来源:期刊VIP网所属分类:预防医学发布时间:2013-09-26浏览:次
【摘要】目的:建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜(BBF)的模型,考察注射用双黄连对BBF形成的影响及抑制作用。方法:在特定的条件、方法下分别对细菌单独培养和细菌与提取物共同培养,通过酶标仪测量其OD值来考察BBF的生长能力。结果:注射用双黄连对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌BDF的形成均有抑制作用。文章发表在《健康之路》上,是医学论文发表范文,供同行参考。
【关键词】双黄连;细菌生物膜;影响
建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜(BBF)的模型,考察注射用双黄连对BBF形成的影响及抑制作用。
1 BBF模型的建立
1.1 大肠杆菌BBF模型的建立1.1.1 菌种的复活将大肠杆菌冻干粉加入0.4mlNB培养基溶解后,放入37℃恒温振荡器(230~240转/分钟)中培养8小时,分装在离心管中,加入0.5ml的50%甘油,置于液氮中,于-80℃冰箱中冷藏保存。
1.1.2 大肠杆菌BBF模型建立的方法将置于-80℃冰箱中的大肠杆菌划线于NB培养基的平板上,置于恒温培养箱中,于36℃培养24小时。挑取平板上的单一菌落溶于5mlNB液体培养基中,于36℃恒温振荡器中振荡8小时,得到单克隆细菌增殖培养的菌液,备用。
将菌液稀释100倍置于96孔板中,四周为NB培养基作为空白。置于恒温培养箱中,于36℃培养24小时,取出。将菌液倾出,用蒸馏水反复清洗后,加入0.1%结晶紫染色30分钟后,将结晶紫倾出,洗净,加入1%脱氧胆酸钠溶液,30分钟后,测其600nm处的OD值。以菌液浓度为横坐标,以OD值为纵坐标,考察BBF生长情况。
1.2 影响大肠杆菌BBF生长的因素通过实验的反复摸索,我们发现影响大肠杆菌BBF生长的因素主要有以下几种:①菌种:不同的大肠杆菌菌株对BBF的影响很大,直接影响到BBF的生长与否和BBF形成的好坏。且大肠杆菌传代越多,BBF的生长情况越不好,故我们每次实验均采用大肠杆菌的第二代菌株。
②96孔板的材质:不同的细菌在不同材质的96孔板上的生长情况是不同的。我们选用了市场上常见的三种96孔板分别是进口聚氯乙烯(PVC)板,国产聚苯乙烯(PS)板,进口聚苯乙烯板,大肠杆菌分别在不同材质的96孔板上培养。结果,大肠杆菌在国产PS板上的生长情况是最好的。
③培养时间:考虑到实验操作时间的可行性,我们选定将大肠杆菌分别培养18小时、24小时、36小时,考察BBF的生长情况。结果,大肠杆菌在培养24小时后,BBF的生长情况最好。
1.3 金黄色葡萄球菌BBF的建立及影响因素金黄色葡萄球菌的BBF模型的建立方法基本上与大肠杆菌的相同。在这里就不做详细的介绍。我们仍旧分别考察了96孔板的材质、培养时间及菌液浓度等因素,最终确定金黄色葡萄球菌菌液稀释100倍、于国产PS板上培养24小时,BBF的生长的最好且稳定。
2 注射用双黄连对BBF的影响
2.1 培养方法的建立我们建立两种方法分别考察药物对BBF形成的影响及对BBF的抑制作用。96孔板的点样方法1:四周为菌液(NB培养基)。B行加入180μl菌液(NB培养基),C~G行每孔各加入100μl菌液(NB培养基),B行每孔用移液枪加入20μl药液,混匀,用多通道移液枪从B行吸出100μl移入C行,混匀,再从C行吸出100μl移入D行,依此类推至H行,吸出100μl后,弃去。即从B~H行药液浓度以2倍递减。96孔板的点样方法2:四周为菌液。B~G行加入100μlNB培养基,B行每孔用移液枪加入100μl药液,混匀,用多通道移液枪从B行吸出100μl移入C行,混匀,再从C行吸出100μl移入D行,依此类推至H行,吸出100μl后,弃去。即从B~H行药液浓度以2倍递减。
培养方法一:考察对BBF形成的影响。
按“96孔板点样方法1”完成后,依照“大肠杆菌BBF模型建立的方法”中置于恒温培养箱中,于36℃培养24小时,以药液浓度为横座标,以平均OD值为纵坐标,作图,考察对BBF形成的影响。
培养方法二:考察对BBF的抑制作用我们先将96孔板全部点菌液,依照“大肠杆菌BBF模型建立的方法”置于恒温培养箱中,于36℃培养24小时,取出,此时BBF已经形成,将菌液倾出,按“96孔板点样方法”,将培养基培养24小时,以药液浓度为横座标,以平均OD值为纵坐标,考察对BBF的抑制作用。
2.2 考察对BBF形成的影响
图1注射用双黄连对大肠杆菌BBF形成的影响
将注射用双黄连加水溶解,配制成5mg/ml的药液,分别进行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养的操作。注射用双黄连对大肠杆菌BBF形成的影响结果见图1所示。
3 讨论
1)通过实验摸索,建立了可靠而稳定的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜(BBF)的模型,确定了影响因素。
2)96孔板清洗方法的摸索:96孔板的材质是BBF模型能够成功建立的重要因素,确定96孔板的清洗方法:先在96孔板内加注洗液,浸泡3~5分钟后,用手握持96孔板,甩干孔内液体;再用乙醇浸泡24小时后超声20分钟,自然晾干,即可。
3)考察了注射用双黄连对BBF形成的影响。得出注射用双黄连对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌BBF的形成均有明显的抑制作用。
4 结语
本实验建立了可靠而稳定的BBF模型,并通过此模型考察了中药注射用双黄连对BBF形成的影响,筛选出能够抑制或破坏BBF形成的活性成分,为从中药中开发治疗慢性感染性疾病的新药提供新的筛选模型,为科学、客观评价中医药在治疗慢性感染方面的作用提供了新的方法。
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文章名称: 医学论文发表注射用双黄连对细菌生物膜影响
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