探究白背叶根抗乙型肝炎病毒体外实验

　　摘要：白背叶根为大戟科野桐属植物白揪的根，在我国分布较广，资源丰富。异名白膜根、野桐根，味微苦、涩、性平，有清热、利湿、固脱、消淤等功效。民间常用鲜根水煎服治疗急慢性肝炎。动物实验证实白背叶根具有较好的抗肝纤维化、抗肝炎和抗肝伤作用〔1，2〕，为进一步了解白背叶根对HBV复制的影响，我们用HepG2.2.15细胞株为模型，观察白背叶根体外抗HBV活性，并对其作用机理初步探讨。

　　关键词：白背叶根, 抗乙型肝炎病毒, HepG2.2.15细胞

　　目的观察白背叶根体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法以HepG2.2.15细胞株为模型，用微粒酶免疫测定技术(MEIA)检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg含量，用PCR荧光定量技术检测细胞上培养上清液中HBV DNA的变化，以MTT比色法观察药物的细胞毒性。

　　结果白背叶根对HepG 2.2.15细胞的TC50为48.25 mg/ml，对抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的治疗指数分别为13.26和43.08。对HBVDNA仅有微弱抑制作用。结论白背叶根在体外细胞培养中具有直接抗HBV活性。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物白背叶根煎煮，水浴蒸发浓缩为2 g/ml，以8层细纱布粗滤后，经1 500 r/min离心10 min，上清液再用定性过滤液纸粗滤，25℃下测pH值为5.09，调节pH值为7.09，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃存放备用。干扰素α1b(赛若金)由深圳科兴生物工程股份有限公司提供，10万IU/支(实验用药)。

　　1.2 细胞培养Hep G 2.2.15细胞来自南方医科大学(原第一军医大学)全军病毒性肝炎重点实验室。将HepG 2.2.15细胞接种于DMEM混合培养液(含20%胎牛血清、0.03%L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素、380 μg/mlG418)，置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。换液1次/3 d，6~10 d传代。每次换液留取上清，检测HBVDNA分泌情况，表达稳定后开始实验。

　　1.3 药物对HepG 2.2.15细胞的毒性实验根据Sargent JM等〔3〕建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。将白背叶根提取液用DMEM混合培养液分别稀释成1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96 mg/ml和1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96 μg/ml等20个实验浓度，培养细胞用胰蛋白酶消化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔0.1 ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养，于48 h后换入不同浓度含药DMEM混合培养液，同时设无药物细胞对照组，每浓度4孔，每4天换新鲜含药培养液，共2次。第8天每孔加入MTT溶液(1 mg/ml)200 μl，继续在37℃下孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清，然后每孔加入150 μl DMSO，震荡10 min，使结晶物充分溶解，置入酶联检测仪中以570 nm波长测定各孔光吸收值(OD值)，重复3次，依照ReedMuench法〔4〕计算药物对HepG 2.2.15细胞的抑制百分率(%)=(细胞对照组平均A组-实验组平均A值)/细胞对照组平均A值×100%;细胞半数有毒浓度(TC50)=Antilg〔lgB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率)×C〕×100%，治疗指数(TI)=半数有毒浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50)。TI>2为有效低毒，12为低效低毒，TI<2为毒性作用。注：A=lg>50%药物浓度，B=lg<50%药物浓度，C=lg稀释倍数。

　　1.4 药物应用培养细胞用胰岛蛋白酶化，配制成浓度为10×104/ml的细胞悬液接种于24孔培养孔，每孔1 ml，37℃、饱和湿度、5%CO2培养，根据药物毒性度验结果，于48 h后换入6种不同浓度(31.25，15.63，7.82，3.91，1.96，0.98 mg/ml)的细胞全培养液，阳性对照药物为干扰素α1b(赛若金100，200，400IU)，同时设不含药物的细胞对照组。每4天换新鲜含药培养液，共2次，于第4，8天留取培养液作为检测标本-20℃保存，同批次试剂同一时间检测。

　　1.5 上清液中HBsAg，HBeAg的检测采用微粒酶免疫(MEIA)测定技术(美国Abbott公司AXSYM全自动免疫分析系统及试剂盒)检测，结果以S/CO值表示。抑制率=(细胞对照组S/CO值-药物组S/CO值)/细胞对照组/S/CO值×100%。

　　1.6 上清液中HBVDNA的提取及定量检测采用PCR荧光定量技术检测上清液中HBV DNA定量。每个浓度重复测定3次，取平均值。HBV DNA抑制百分率(%)=(细胞对照组平均A值-实验组平均A值)/细胞对照组平均A值×100%。

　　1.7 统计学分析结果用±s表示，组间比较用方差分析，采用SPSS11.0完成。

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文章名称： 探究白背叶根抗乙型肝炎病毒体外实验

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