外源性胰岛素对胰岛素一相分泌有什么影响

　　【摘要】大鼠胰腺经胶原酶消化及纯化后，获得分散较好、纯度较高的胰岛，呈圆形或椭圆形，胰岛结构完整，界限清楚，镜下为不透光实体，双硫腙染色呈深红色(图1)，表明为含有β细胞的胰岛细胞团，每只大鼠胰腺平均获得直径在100~300 μm之间的胰岛约为(337.80 ±21.36)个.

　　【关键词】 胰岛;细胞，培养的;大鼠;胰岛素;时间反应曲线

　　目的： 探讨外源性胰岛素对离体大鼠胰岛第一时相胰岛素分泌的影响. 方法： 雄性SD大鼠胰腺采用Ⅴ型胶原酶经胰管灌注消化分离得到胰岛，用100 μU/mL外源性胰岛素分别孵育0， 60，120和240 min(n=8)后，给予葡萄糖刺激，分别测定0，3，5，10和30 min胰岛素分泌量. 结果： 不同时间胰岛素预处理后，各组在葡萄糖刺激时均产生胰岛素第一时相分泌(P0.05)，但随着胰岛素孵育时间的延长，胰岛素第一时相分泌峰值降低(P0.01). 结论：100 μU/mL外源性胰岛素损害胰岛素第一时相分泌，且孵育时间越长，抑制程度越明显.

　　正常人的β细胞受到葡萄糖负荷刺激时呈双相式胰岛素分泌. 第一时相胰岛素分泌表现在β细胞受到葡萄糖刺激后l min开始，3～5 min时达峰值，持续约10 min. 第一时相胰岛素分泌虽然短暂，但在调节血糖水平中具有重要的生理意义. 葡萄糖诱导的胰岛素第一时相分泌受损是胰岛β细胞功能障碍的最早标志〔1〕，并预示着2型糖尿病的发生. 目前外源性胰岛素对胰岛β细胞胰岛素分泌的作用尚无定论，有关对胰岛素第一时相分泌的影响的研究报道也较少. 本研究通过观察离体胰岛在外源性胰岛素预处理后对葡萄糖刺激的第一时相分泌的变化，为进一步探讨外源性胰岛素对于胰岛β细胞胰岛素第一时相分泌的影响提供依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性SD大鼠35只，体质量 250～300 g，购于第四军医大学试验动物中心. 胶原酶V， Histopaque1077， 双硫腙购于美国Sigma公司;胰岛素放免试剂盒购于北京北免东雅公司;RPMI1640，小牛血清购于Gibco公司; 其他试剂均为国产分析纯. 胶原酶Ⅴ溶液含NaCl 124 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 7.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 2.4 mmol/ L，葡萄糖3 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，V型胶原酶 0.60 g/L(pH 7.8).

　　1.2方法

　　1.2.1胰岛的分离及纯化

　　固定大鼠后备皮，200 g/L乌拉坦7 mL/kg腹腔注射麻醉. 剖腹充分暴露胰腺,于无菌条件下胆总管内插入4.5号头皮针，逆行注入预冷的胶原酶Ⅴ溶液8～10 mL，使胰腺膨胀，迅速摘取整个胰腺，38℃水浴中静止消化10 min. 振荡15 s使其呈细砂状，充分分散胰腺组织，再加入4℃小牛血清10 mL与4℃ Hanks液30 mL终止消化. 40目筛网过滤，除去未完全消化的组织，之后1000 r/min离心2 min，弃上清液，加入Hanks液清洗组织，重复以上三个步骤3～5次，直至离心后上清中无杂物. 完全弃去上清，加入Histopaque1077约5 mL，充分混匀，移入15 mL离心管，然后小心加入Hanks液约5 mL，形成一个层面. 逐渐加速至2000 r/min离心20 min. 在Hanks液与Histopaque1077形成的层面上收集胰岛. 用RPMI 1640 洗2遍后1000 r/min离心2 min即得到纯化后的胰岛〔2〕.

　　1.2.2胰岛的鉴定

　　胰岛用双硫腙溶液鉴定〔3〕. 双硫腙溶液配制如下：10 mg双硫腙溶于3 mL无水乙醇中，加入3滴1 mmol/L氨水溶液，形成深红色母液，用Hanks液1∶10稀释,然后加入到收集纯化胰岛中，记数红染细胞团.

　　1.2.3胰岛素胰岛孵育及胰岛素分泌功能测定

　　将分离纯化后的胰岛放入预先加有RPIM1640培养液的24孔板，50个胰岛/孔，加入外源性胰岛素使其终浓度达100 μU/mL孵育胰岛，分别孵育0， 60，120和240 min，(设0 min为对照组)然后用Hanks液(含3 mmol/L葡萄糖)洗涤2遍中止孵育. 每孔加入Hanks液定容1 mL，给予终浓度为16.7 mmol/L葡萄糖刺激(240 min组再给予终浓度为16.7 mmol/L葡萄糖加10 mmol/L精氨酸刺激)，分别在0，3，5，10和30 min吸取上清100 μL 作为待检样品，每个孵育组各重复8次，用放射免疫法测定胰岛素分泌情况.

　　统计学处理： 计量资料用x±s表示，组间比较使用SPSS 11.0软件进行方差分析及LSDt检验.

　　2结果

　　2.1胰岛的形态及活性

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文章名称： 外源性胰岛素对胰岛素一相分泌有什么影响

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