盐芥叶片应答盐胁迫的蛋白质组学分析

　　摘要： 盐芥是研究耐盐机理的模式植物。为从蛋白质水平揭示盐芥响应盐胁迫的分子机制，本研究采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ) 技術对不同NaCl浓度处理7 d的盐芥叶片进行差异蛋白质组学分析。结果表明，盐芥叶片中共鉴定到4 607个蛋白质，其中281个蛋白质的表达丰度显著增加，95个蛋白质的表达丰度显著降低。盐胁迫差异表达蛋白质的KEGG代谢通路和蛋白质互作网络分析结果表明，促进植株光合作用可帮助盐芥适应低盐环境;抑制叶绿素和支链氨基酸合成、调控应激反应基因的表达是盐芥应对中盐环境的重要因素;而有效清除活性氧、提高渗透物质积累量和增加能量供应可能是盐芥耐受高盐环境的关键。本研究结果为揭示盐芥应答盐胁迫的分子响应机制提供了理论基础。

　　关键词： 盐芥;盐胁迫;差异蛋白质;iTRAQ

　　盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中的高浓度盐分会使植物体内离子失衡，产生渗透压力，从而严重影响植物的生长和发育[1]。盐芥是一年生草本植物，属真盐生植物，多生长于盐渍化土壤中。盐芥是拟南芥的近亲[2-3]，同样具有生长周期短、基因组构成小(约为拟南芥的2倍)、种子数目多、可利用农杆菌侵染花序法进行遗传转化试验、遗传转化效率高等特点。因此，近几年盐芥被提出作为耐盐分子机理研究的理想模式植物[2，4-5]。虽然盐芥和拟南芥有很多相似的特性，但两者之间的耐盐性却存在很大差异。通过转录组和蛋白质组学技术分析拟南芥和盐芥在响应盐胁迫的差异时，发现拟南芥中存在的盐胁迫响应基因，不管是否处于盐胁迫环境，在盐芥中均能高丰度表达[6-7]，说明盐芥在面对逆境时是“有备无患”;而且盐芥中存在特有的新陈代谢途径，使得其在盐胁迫条件下能减少由植物激素所诱导的生理修饰[8]，从而能在一定程度上承受更大的胁迫压力。同时研究发现，盐胁迫条件下，盐芥根系的磷酸化蛋白质组发生改变，这些变化的磷酸化蛋白质参与了信号转导、活性氧清除、能量途径、蛋白质合成以及蛋白质折叠等过程[9]，这些研究为将来从磷酸化水平上研究盐芥的耐盐机制提供了重要的理论依据。

　　目前，人们已从盐芥中鉴定到一些与盐胁迫耐受相关的基因和调控因子，如编码K+/Na+转运蛋白基因(ThHKT1)[10-11]、编码細胞质膜和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因(ThNHX1)和(ThSOS1)[12-14]、焦磷酸酶基因(TsVP) [15-17]、高亲和性K+转运体(ThHAK5)[18]、脯氨酸合成基因(ThP5CS)[19]、Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(ThCSD)[20]等，且部分基因的生物学功能已得到一定的阐述。我们前期对盐芥叶片和叶绿体响应盐胁迫的比较蛋白质组学的研究结果表明，盐芥可通过Na+液泡区隔化，积累渗透调节物质(如淀粉、可溶性糖、脯氨酸等)，以及维持光合效率和生长发育等方式来适应盐胁迫环境[21-22]。本研究在已有的研究基础上，应用先进的同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)对不同盐浓度处理条件下的盐芥叶片进行比较蛋白质组学研究，并重点分析不同盐浓度处理对盐芥叶片蛋白质表达丰度的影响，期望揭示盐芥适应不同盐浓度条件的蛋白质化学机制，为揭示盐芥耐盐分子机制提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料与试验设计

　　将盐芥种子直接点播在基质土(营养土∶蛭石=1∶1，体积比)中，放置在培养箱中进行培养。培养条件：温度为白天22 ℃，晚上20 ℃;相对湿度为60%±5%;16 h光照，8 h黑暗。种子发芽后，用1/2浓度Hoagland营养液每3 d浇灌1次。2个月后，挑选长势一致的盐芥植株用含有0 mmol/L、200 mmol/L(低盐)、400 mmol/L(中盐)和600 mmol/L(高盐)NaCl的1/2浓度Hoagland营养液进行浇灌，每天更换新的营养液，每个盐浓度处理36株植株。收集连续浇灌7 d(根据前期的预试验确定的盐处理时间)的盐芥叶片，每12株为1个生物学重复，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

　　1.2 盐芥叶片蛋白质的提取、酶解及iTRAQ分析

　　参照Wang等[23]的BPP法提取盐芥叶片总蛋白质，用预冷的甲醇和丙酮清洗蛋白质沉淀，然后溶解在蛋白质裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS(一种非变性的两性离子型去垢剂)，30 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)中。以牛血清白蛋白(BSA)为标准溶液，通过Bradford测定法测定蛋白质浓度[24]。取100 μg用不同浓度的NaCl处理的盐芥叶片总蛋白质，用胰蛋白酶进行消化后，使用iTRAQ试剂分别标记0 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和 600 mmol/L NaCl处理的上述叶片总蛋白质酶解产物后，再进行等量混合。采用强阳离子变换(SCX)色谱柱(4.6 mm×250.0 mm， Aqua C18， 5 μm， 100 )对iTRAQ标记的肽段进行预分级，再通过液相串联质谱对标记肽进行鉴定，获取差异表达肽段信息。

　　1.3 质谱数据搜库

　　使用Proteinpilot软件(Version 4.5)对质谱结果进行搜库，搜索数据库为自建的盐芥蛋白质数据库，蛋白数据从美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12266)上下载。搜库参数设置为：酶类为Trypsin，错误剪切位点数为1，固定修饰位点为Carbamidomethyl(C)，可变修饰位点为Oxidation(M)。将0 mmol/L NaCl处理盐芥叶片蛋白质作为对照组，200 mmol/L NaCl、400 mmol/L NaCl、600 mmol/L NaCl作为处理组，按处理组与对照组离子的峰面积比值，选择置信度在95%以上的结果进行报告。质谱鉴定出的可信蛋白质筛选参数应满足：可信度在95%以上的肽置信水平，至少鉴定出2条肽段，且错误发现率(FDR)≤1%。

　　1.4 质谱数据生物信息学分析

　　通过KEGG途径分析对可信鉴定的蛋白质参与的代谢通路进行富集。同时，对盐胁迫差异表达蛋白质(变化倍数>1.50或<0.67，P<0.05)进行KEGG代谢途径和蛋白质间相互作用网络分析(https：//string-db.org/cgi/input.pl)。

　　1.5 部分盐胁迫差异表达蛋白质对应基因的qRT-PCR分析

　　提取用不同盐浓度处理的盐芥叶片总RNA，取1 μg总RNA反转录成cDNA，并将反转录后的cDNA样品稀释5倍后用于qRT-PCR分析，每个样品至少重复3次qRT-PCR试验。取1 μl稀释后的cDNA加入到SYBR Green PCR Master mix体系中，使用Mx3005P荧光定量PCR仪进行qRT-PCR试验，盐芥的actin基因(NCBI基因登录号312283264)作为内参基因。用于qRT-PCR的引物序列详见表1。

　　2 结果与分析

　　2.1 盐芥叶片蛋白质种类分析及盐胁迫差异表达蛋白质的筛选

　　应用iTRAQ技术结合AB5600+高端生物质谱仪对盐芥叶片总蛋白质进行定量分析，3次iTRAQ重复鉴定出的可信蛋白质数分别为3 750个、3 897个和3 901个，共计4 607个蛋白质至少在1次重复中鉴定到的可信的盐芥叶片总蛋白质，其中3 811个蛋白质至少在2次重复试验中得到可信鉴定(图1A)。这3 811个可信蛋白质参与了18条代谢途径，其中碳水化合物代谢途径参与的蛋白质种类最多(988个蛋白质)，其次是翻译类蛋白质(895个蛋白质)与折叠、分类和降解类蛋白质(830个蛋白质)、氨基酸代谢(579个蛋白质)、信号转导(547个蛋白质)、运输和分解代谢(522个蛋白质)、脂质代谢(496个蛋白质)、环境适应(452种蛋白质)、能量代谢(416种蛋白质)等代谢途径类蛋白质(图1B)。

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文章名称： 盐芥叶片应答盐胁迫的蛋白质组学分析

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