高效絮凝菌的分离鉴定及其絮凝条件的优化

　　摘要 采用微生物分离纯化技术从底泥样品中筛选到一株絮凝菌，通过目标菌株的形态学特征和16S rRNA序列分析以鉴定其种屬，并对其发酵条件和絮凝条件进行优化。结果表明，XN1-4为黏质沙雷氏菌;XN1-4在发酵28 h后其发酵液的絮凝效果最好。菌株XN1-4的最佳培养条件为培养基初始pH 5.0、培养温度25 ℃、摇床转速150 r/min;最佳絮凝条件为发酵液投加量4%、助凝剂投加量4%。在最佳絮凝条件下，XN1-4的絮凝率达到98%，且絮凝活性成分主要存在于菌体本身。

　　关键词 絮凝菌;分离鉴定;培养条件;絮凝条件;优化

　　随着社会经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，日益凸显的河湖生态环境问题也越来越受到关注和重视。虽然，目前也采取了许多截污措施，但由于人口及工业的快速发展，水体富营养化等水生态环境问题仍然日益严重[1-3]，许多地方的河流及湖泊均出现了不同程度的水体富营养化现象，藻类大量繁殖、水体透明度和溶解氧都明显降低[4]，不仅严重影响了水体生态系统，而且严重危害了人类的身心健康[5]。因此，高效修复富营养化等被破坏的水体成为亟待解决的生态环境问题。然而，目前对富营养化等受到破坏的水体多采用物理或化学等方法，效果并不十分理想，并且容易产生二次污染等问题，因此，迫切需要寻找一种高效且不产生二次污染等问题的方法。

　　微生物絮凝剂是一类微生物在生长繁殖过程中代谢分泌产生的一种高分子活性物质[6]，如蛋白质、多糖、脂类和核酸等[7-8]，能够絮凝、沉降水体中的悬浮颗粒、色素等物质，具有安全高效、绿色环保、可生物降解等优点，不会引起二次污染[9-11]。陆洪省等[12]将絮凝菌SKDXN-1应用于富营养化水体的治理，该菌株处理富营养化水体10 d后，水中叶绿素a去除显著，去除率达89.10%，对水体总氮、总磷和COD的去除率分别为10.5%、15.6%和44.5%，具有一定的生态修复效果。但由于微生物絮凝剂在实际水污染治理应用方面存在用量大、成本高的问题[13]，目前并没有被广泛应用于水体生态修复中，因此筛选高效絮凝剂产生菌、提高絮凝剂的絮凝效果、降低絮凝剂用量[14-15]，是该领域当前研究的重点[16-17]。

　　目前，絮凝剂产生菌大多是从活性污泥、土壤、河流、深海等环境中筛选而来[18-19]，以湖泊底泥为对象筛选絮凝菌的研究较少报道[20]。笔者以湖泊底泥为筛选对象，分离筛选到一株絮凝菌，通过形态学、生理生化以及16S rRNA进行菌种鉴定，并研究絮凝菌的最适培养条件和絮凝条件，为絮凝菌在水体生态修复中的应用奠定理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 样品来源

　　现场利用柱状底泥采样器采集漳州市峰头水库浅层底泥，准确称取10 g浅层底泥样品于无菌的250 mL三角瓶中，加入适量无菌水和玻璃珠，在旋涡振荡器上充分振荡均匀。

　　1.2 培养基

　　富集培养基：牛肉膏 5 g、 蛋白胨 10 g、 氯化钠10 g，溶于蒸馏水中，调pH 7.2～7.4，定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。

　　分离培养基：在富集培养基的基础上加1.5% 的琼脂。通用发酵培养基：葡萄糖 20.0 g、KH2PO4 2.0 g、K2HPO4 5.0 g、 (NH4)2SO4 0.2 g、 NaCl 0.1 g、脲0.5 g、酵母膏 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g，溶于蒸馏水中，调pH 7.2～7.4，定容至1 000 mL，115 ℃灭菌30 min。

　　1.3 菌种富集与分离纯化

　　吸取10 mL充分混匀的样品溶液于装有100 mL富集培养基的 250 mL 三角瓶中， 30 ℃ 150 r/min 振荡培养48 h，待培养基浑浊后，再次转移10 mL溶液至新的富集培养基中，同等条件下振荡培养48 h，如此重复富集2～3次。取最终富集培养液，梯度稀释至1×10-6、1×10-7、1×10-8，分别取100 μL涂布于分离培养基上，30 ℃培养48 h。挑取表面光滑黏稠的单菌落， 于分离培养基上多次平板划线纯化直至得到单菌落，斜面保存备用。

　　1.4 高效絮凝菌的筛选

　　分别挑取已分离纯化的各菌株接种于装有100 mL 通用发酵培养基中，在 30 ℃、150 r/min 的条件下振荡培养 48 h后， 吸取2 mL菌液测定发酵液的絮凝活性，每次测定重复 3 次， 取平均值。

　　絮凝活性测定方法：取2 mL菌液、2 mL质量分数为1%的CaCl2溶液加入46 mL 0.4 g高岭土悬浮液中，置于磁力搅拌机上搅拌，控制条件为200 r/min下快搅1 min，然后100 r/min下慢搅3 min。静沉5 min，吸取上清液于550 nm下测定吸光度，同时以未接种的发酵培养基作为空白对照，确定菌株发酵液的絮凝活性。按照公式(1)计算絮凝率。

　　絮凝率=(A-B)/A×100%(1)

　　式中，A为未接种发酵培养基的OD550，B为样品的OD550，以蒸馏水做参比。

　　1.5 絮凝菌的鉴定

　　1.5.1 形态学鉴定和生化鉴定。

　　将筛选得到的菌种接种于营养琼脂培养基上， 在 30 ℃ 下培养 48 h， 对菌株进行革兰氏染色， 油镜下观察菌体形态。用富集培养基将菌株在 30 ℃ 下培养至对数生长期，将菌液按照无菌操作技术接入细菌生化鉴定管中， 30 ℃、150 r/min 条件下振荡培养 48 h 后观察记录结果。

　　1.5.2 16S rRNA基因序列的测定分析。

　　使用DNA提取试剂盒提取目标菌株的基因组DNA，采用16S rRNA基因通用引物扩增获得PCR产物，经电泳检测后，直接交由上海生工进行测序，要求双向测通。所得测序结果提交GenBank进行Blast序列比对分析。

　　1.6 絮凝菌的生长特性分析

　　将筛选获得的絮凝菌在富集培养基中活化培养24 h，作为种子液。取2%菌种液转接至通用发酵培养基中，培养温度为30 ℃，搖床转速为150 r/min，每隔4 h取样1次，取样时长为48 h，测定发酵液中的细菌密度(OD600)和絮凝率，以未接菌种液的培养液为对照。绘制菌株的生长曲线及絮凝率变化曲线，以确定最佳的发酵时间。

　　1.7 絮凝活性分布

　　吸取30 mL发酵液于50 mL离心管中，在5 000 r/min离心10 min，移取上清液至新的离心管中，用蒸馏水洗涤菌体沉淀2次，再用等体积的蒸馏水重悬菌体，制成细胞悬浮液。分别测定发酵原液(含细胞)、 上清液以及细胞悬浮液的絮凝率。

　　1.8 发酵条件优化

　　在其他培养条件不变(培养基初始pH为7.0，培养温度为30 ℃，转速为150 r/min)的基础上，以其中的一个单因素为变量，发酵培养48 h后取样测定絮凝率，分析不同培养条件对絮凝活性的影响，以得到目标菌株的最佳培养条件。①培养基初始pH：采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH，将初始pH分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。②培养温度：在上述已得到的最佳培养条件下，设定不同培养温度(20、25、30、35、40 ℃)。③转速：在上述已得到的最佳培养条件下，设定不同摇床转速(100、120、150、180、200 r/min)。

　　1.9 絮凝条件优化

　　在最佳培养条件下，探讨不同絮凝条件对目标菌株絮凝活性的影响，以确定最佳絮凝条件。①发酵液投加量：设定不同体积分数的发酵液投加量(1%、2%、3%、4%、5%)。②助凝剂投加量：设定不同体积分数的助凝剂投加量(1%、2%、3%、4%、5%)。

　　2 结果与分析

　　2.1 絮凝菌种筛选结果

　　经富集、分离、纯化，从底泥样品中共分离出20株菌落表面光滑黏稠的菌株，其中有17株具有絮凝活性。由表1可知，XN1-4、XN2-5、XN3-1、XN3-4这4株的初筛絮凝率均超过30%，可作为复筛备用菌株。

期刊VIP网，您身边的高端学术顾问

文章名称： 高效絮凝菌的分离鉴定及其絮凝条件的优化

文章地址： http://www.qikanvip.com/shengwukexue/61170.html