基因工程表达内含肽介导的抗菌肽(MME)及其酰胺化

　　摘要：【目的】探讨在巯乙基磺酸钠(MESNa)与碳酸氢铵(NH4HCO3)存在下，对在大肠杆菌上表达的重组融合蛋白中内含肽(Intein)用硫醇(DTT)进行自剪切，促使抗菌肽(MME)碳末端实现酰胺化。【方法】构建用大肠杆菌表达内含肽介导的MME重组质粒，通过表达获得依次由“组氨酸、Sumo标签、MME、内含肽”构成的融合蛋白，用镍柱及透析进行纯化，在MESNa和NH4HC03存在下，用DTT对内含肽进行白剪切，促使MME碳末端酰胺化，肠激酶切割、纯化，得到碳末端酰胺化的MME。质谱和二级串联质谱配合使用，检測MME及其碳末端酰胺化。【结果】通过PCR，鉴定融合蛋白，其基因片段为837bp，符合预期。质谱鉴定得MME相对分子量为3057.7与其理论值3057.64一致。二级串联质谱检测得MME碳端碎片的分子量为1214.728，与碳末端酰胺化的MME碳端碎片理论分子量1214.739相符，匹配度为45，表明本研究制备的MME碳末端已被酰胺化，该蛋白为可溶。【结论】用大肠杆菌成功地表达了重组融合蛋白，在MESNa与NH4HCO3存在下，促进了内含肽白剪切，MME碳末端被酰胺化，实现了简单的“一步法”制备。质谱与二级串联质谱配合使用，可灵敏、简单地对碳末端酰胺化多肽进行检测，可作为该项检测方法的一种选择，结果表明，本研究成功地制备了碳末端酰胺化的MME。

　　关键词：抗菌肽;酰胺化;内含肽介导;自剪切

　　0引言

　　【研究意义】抗生素过度使用出现的食品药残和细菌耐药性问题[1]，使畜禽饲养中抗菌问题遇到了极大麻烦。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPS)抗菌谱广，细菌不大可能对其耐药[2]。但要使AMPS产业化，主要还面临着要提高其活性[3]和半衰期，降低其毒性和生产成本。本课题组设计并化学合成了抗菌能力强、半衰期长、毒性低的碳末端酰胺化的抗菌肽(MME)，其氨基酸序列为：GRGDSPKFLHSAKKFGKAFPAVLKVLTTG[4]。本研究探讨通过基因工程表达法，生产目标抗菌肽MME以期降低生产成本。

　　【前人研究进展】获得AMPS方法有3种：从生物体中提取、化学法合成和基因工程表达，其中第三种方法成本最低[5]。基因工程表达系统有多种，其中大肠杆菌(E.coli)表达系统优势明显，因此被广泛采用[6]。碳末端酰胺化的AMPS在人体内有重要的生理功能，其碳端末端的α-酰胺基对AMPS的活性起着很重要作用，有些AMPS在酰胺化前后的生物活性相差可达万倍[7];其还可起保护作用，减弱蛋白酶对AMPS的降解，延长AMPS的半衰期[8]。可是大肠杆菌直接表达的多肽产物碳末端均为羟基。为此，研究者提出先用基因工程手段表达碳末端为羟基的多肽，然后再进行第二步的酰胺化修饰，最终获得碳末端酰胺化的目标多肽。如：重组表达α-酰胺化酶在体外进行多肽C端酰胺化，用溴化氰裂解融合表达产物所得的鲑鱼降钙素的体外酰胺化加工。

　　但这些工艺都存在一些不足，前者在酰胺化过程中需提供酰胺化工具酶，制备中纯化步骤多，技术要求较高，成本较大[9];后者在酰胺化过程中要使用溴化氰[10]，会对环境造成污染，制约了他们的大规模生产。现在研究者仍投入大量精力，以期开发出更完善的工艺[7]。存在于前体蛋白结构中的内含肽(Intein)序列，能从前体蛋白中白我剪切，还能将剪切下的两侧肽链连成肽键。Li Yifeng[11]对内含肽的生物应用做了较全面的介绍，周冠、俞超等[7，12]用内含肽介导表达天蚕素多肽，仅用硫醇DTT对表达的融合蛋白中含有的内含肽进行自剪切，同时使融合蛋白中含有的抗菌肽碳末端实现酰胺化。Stevens A J[13]在用DTT使内含肽自剪切时，加入了NH4HC03，以利于多肽碳末端的酰胺化。对碳末端酰胺化的抗菌肽的检测，也是困扰研究者的又一大问题[14]。

　　【本研究切人点】前人研究表明，用大肠杆菌表达系统，最终要获得碳末端酰胺化的AMPS还存在不少困难，主要问题是促进表达产物碳末端的酰胺化。通过酰胺化酶对大肠杆菌表达所得前体蛋白进行酰胺化与用化学合成制备法比较，虽可简化纯化工艺[14]，但需二步法制备[7]，过程仍较复杂;用内含肽介导在大肠杆菌上表达含MME的融合蛋白，通过DTT实现内含肽白剪切，虽可实现一步法制备碳末端酰胺化多肽，但酰胺化过程困难[7，12]。本研究探讨在上述酰胺化体系中，引入巯乙基磺酸钠(MESNa)和碳酸氢铵(NH4HCO3)，促进MME碳末端酰胺化的进行;将质谱和二级串联质谱配合使用，鉴定MME，并检测其碳末端酰胺基的存在。【拟解决的关键问题】本研究探讨在MESNa和NH4HCO3存在下，用DTT对内含肽进行白剪切，促进多肽碳末端酰胺化;将质谱与二级串联质谱配合使用，希望能探索一种灵敏、简单地检测AMPS碳末端酰胺化的方法，促进对多肽碳末端酰胺化的研究。

　　1材料与方法

　　1.1主要试剂、仪器及材料

　　1.1.1主要试剂与仪器 质粒抽提、凝胶回收试剂盒(天根生物公司)，NdeI、XhoI和肠激酶(EK)[TaKara(大连)公司]，蛋白maker[TaKara(大连)公司]，大肠杆菌BL21(DE3)(本室保存)，PET30a(本室保存)，6×His标签抗体(上海生工)，IPTG、硫醇(DTT)(Solarbio)，Ni-NTA beads 6FF(天地人和公司)，其余试剂为国产分析纯，电泳系统、成像系统(Tahon)，半干电转仪(Tahon)，紫外可见分光光度计(日本HITACHI)，高效液相-电喷雾质谱( Aglient)。

　　1.1.2主要溶液配制 缓冲溶液Buffer简记：Buf，Buf A中DTT浓度为1mmol·L-1，Buf(B、C、D)中咪唑浓度分别为20mmol·L-1、40mmol·L-1和500mmol·L-1，上述缓冲液的NaCI、Na3PO4浓度分别为500mmol·L-1和25mmol·L-1， pH=7.5;Buf(E、F、G、H)中咪唑浓度分别为0、20mmol·L-1、40mmol·L-1、250mmol·L-1，上述缓冲液中的Tris、NaCl、甘油的浓度分别为20mmol·L-1、300mmol·L-1和10%，pH=8.0。

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文章名称： 基因工程表达内含肽介导的抗菌肽(MME)及其酰胺化

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