‘恭城月柿’不同生育期果实和叶片单宁组分含量的变化

　　摘 要： 柿单宁是一种重要的食品功能成分，广泛应用于食品、医疗等领域，研究柿单宁的生物生产特性对其产业应用具有重要意义。该研究以广西特色涩柿品种‘恭城月柿’为材料，测定了幼果期、膨大期、成熟前期、成熟期和成熟后期柿果肉、果皮和叶片的可溶性单宁含量，并利用液质联用色谱对全部样品中6种单宁组分 [没食子酸(GA)、没食子儿茶素(GC)、儿茶素(CA)、芦丁(Rutin)、表没食子儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)]进行了定量分析。结果表明：柿果肉和果皮中含有丰富的可溶性单宁，在膨大期含量最高，分別达到21.93 mg·g-1和18.41 mg·g-1，随着果实进入成熟阶段显著下降;柿叶片的可溶性单宁含量较低，并且在整个生育期内无明显变化。另外，在柿果肉中检测到GA、GC和CA 3种单宁组分，其中GA含量显著高于其他组分;在柿果皮中检测到GA、GC、CA、Rutin和EGC 5种组分，其中CA含量最高，EGC仅在幼果期和膨大期有痕量检出;在柿叶中检测到全部6种单宁组分，其中整个生育期CA含量极高，EGC和EC均为痕量检出。由此可知，幼果期至膨大期的柿果实可产出较多可溶性单宁，其中果肉中含有较多的GA组分，果皮中含有大量的CA组分，柿叶片在整个生育期均可产出极为丰富的CA单宁组分。该研究为柿单宁的功能性开发利用提供基础数据。

　　关键词： 柿， 生育期， 单宁， 组分， 液相色谱质谱联用

　　柿树属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros L.)多年生落叶果树，已有1 000多年的栽培历史(Naval et al.， 2010)。柿果实中含有丰富的糖、酸、维生素、胡萝卜素等营养成分，既可鲜食，也可加工成柿饼、饮品等(顾海峰，2007)。国内外研究报道，柿叶中含有的多酚类、黄酮类、萜类、香豆素类和甾醇类等多种生理活性物质(任飞，2011;杨琼琼等，2016)，具有抗癌、抗衰老、调节免疫等多种药理作用(王燕，2008)。此外，柿含有丰富的单宁类物质，高出普通水果十几倍甚至几十倍。单宁是决定果实涩味的主要因子(Sugiura， 1984)，具有抗氧化(罗正荣和张青林，2009)、抑菌(董晓倩，2014)、缓解蛇毒(徐淑芬等，2011)、清肺止咳(Itamura et al.， 2011)、吸附重金属(罗正荣和张青林，2009)等功效。

　　柿单宁是植物多酚的一种，根据其溶解程度，分为可溶性单宁和不可溶性单宁。可溶性单宁是决定柿果实涩味的主要物质。可溶性单宁可用无水甲醇提取，不可溶性单宁不溶于无水甲醇，而溶于甲醇的水溶液，当提取条件改变时不可溶性单宁可转变为可溶性单宁(胡耀星和谢笔钧，1991;Taira， 1998)。

　　柿单宁不同于其他水果单宁，具有独特的结构特征(Li et al.， 2010)。早在1923年，Komats和Mutsua就对柿单宁分子进行了研究，从柿果实提出多酚类物质，并把这种物质命名为“柿子素” (张宝善和陈绵屏，1997)。其后，Matsuo & Ito(1978)采用NMR的手段鉴定其结构，并提出其主要的组成结构分子为4种儿茶素类(Flavanpentol)单体——表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸(ECG)、表没食子酸酸儿茶素(EGC)和表没食子酸儿茶素没食子酸(EGCG)，组成比例为1∶1∶2∶2，并推测出其分子量约为13 000。前人研究发现，200 g的涩柿约含有80 g儿茶素类，且仅为EC和EGCG，其余则为3 g的可溶性单宁(Salvador et al.， 2007)。

　　柿单宁分子结构多样且复杂，目前对柿单宁的研究主要集中在初步提纯并验证其抗氧化活性方面，对其组成成分的分析和其他功能性的开发较少。因此本研究以广西主栽的特色涩柿品种‘恭城月柿’为材料，研究其不同生育期果实和叶片中可溶性单宁及其单宁组分含量的变化规律，为后續功能性开发提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料、试剂和仪器

　　供试材料：广西大学植物标本园栽植的‘恭城月柿’品种，分别采摘于5个时期：幼果期(2017年8月9日)、膨大期(2017年8月31日)、成熟前期(2017年9月30日)、成熟期(2017年10月28日)和成熟后期(2017年11月19日)。选取大小均匀、成熟度一致、无病虫害且无机械损伤的果实和柿叶，分3个生物学重复测定其单果重、硬度及总色差，同时分离果肉和果皮，液氮冷冻后保存于-40 ℃，以备后续定量分析。

　　试剂：乙腈，质谱纯(Fisher Chemical公司);标准品：儿茶素(CA)、表儿茶素(EC)、没食子酸(GA)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素(EGC)、芦丁(Rutin)，含量≥95%(北京索莱宝科技有限公司);其他试剂均为国产分析纯。

　　仪器设备：质构仪TA.XT.Plus(英国，Stable Micro System公司);超高效液相色谱—四级杆串联飞行时间质谱仪(UPLC-QTOF)(配有可变波长紫外检测器 ADC 和数据采集与分析软件 Masslynx 4.1 工作站，美国Waters公司);旋转蒸发仪;分析天平;离心机。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 单果重、硬度、总色差的测定 每个时期果实分3个生物学重复，每个生物学重复随机取10个果实，用百分之一天平称量，记录单果重并计算平均值。

　　硬度的测定选取质构仪TA.XT.Plus(英国，Stable Micro Systems公司)对果实硬度进行测定，分别选取柿果实赤道上相反方向的两个面，削去果皮，采用直径为5 mm的圆柱形探头进行穿刺测定。

　　总色差的测定采用CR-10色差计对果实色差进行测定(日本，KONICA MINOLTA公司)，记录L、a、b值，计算总色差ΔE值。计算公式：ΔE=(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2。其中，设幼果期的L、a、b值为标准值，其他时期的L、a、b值为测定值，测定值与标准值之差即为ΔL、Δa、Δb值。

　　1.2.2 可溶性单宁的测定 可溶性单宁的测定参照Taira(1996)的方法并做部分改良。取5 g果肉(果皮、柿叶)加入80%的甲醇25 mL，室温下放置10 min，期间摇动3次，于温度为4 ℃，转速为9 500 r·s-1条件下离心20 min，重复提取两次，合并提取液，用80%的甲醇定容至100 mL。样液稀释至1 000 mL，先取稀释后的待测样液1 mL，加入6 mL蒸馏水;摇匀后加入0.5 mL 1 N的福林酚试剂，摇匀，静置3 min;然后加入1 mL饱和Na2CO3溶液和1.5 mL的蒸馏水，摇匀;最后，避光条件下静置1 h，于725 nm处测定吸光值。

　　1.2.3 单宁组分测定 样品制备：提取方法同1.2.2方法，将粗提液浓缩至10 mL，取1 mL于 0. 22 μm 微孔滤膜过滤后装入2 mL进样瓶备用。

　　色谱条件：色谱柱Waters Acquity-BCH C18(100 mm ×2.1 mm，0.18 μm)，流速0. 2 mL·min-1，柱温30 ℃，二极管阵列检测器(ADC)检测波长280 nm，进样量2 μL，梯度洗脱条件见表 1。

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文章名称： ‘恭城月柿’不同生育期果实和叶片单宁组分含量的变化

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