过表达大豆类受体蛋白激酶基因RLPK2促进转基因拟南芥叶片的衰老

　　摘要：大豆RLPK2基因(GenBank登錄号：AY687391)是一个编码N末端富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因。为分析大豆RLPK2基因的功能，该研究以野生型拟南芥和大豆RLPK2基因过表达拟南芥植株为材料，通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥，构建了大豆RLPK2基因过表达载体，分析了叶片衰老过程中叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性及衰老相关基因表达量的变化。结果表明：(1)无论是野生型还是转基因拟南芥，随着叶片衰老进程的进行，光系统Ⅱ(PSⅡ)的最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光化学淬灭系数(qP)和光合电子传递速率(ETR)均呈下降趋势，但后者下降趋势更明显;(2)激发压(1qP)在叶片衰老前期的变化较为平稳，后期则急剧增加，且转基因型比野生型拟南芥增加更明显;(3)在叶片衰老的各个时期，转基因拟南芥叶片丙二醛(MDA)含量均显著高于野生型，而超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著低于野生型;(4)实时荧光定量PCR检测结果表明，RLPK2转基因拟南芥中衰老标志基因ATSAG12，衰老关键转录因子ATNAP、ATWRKY6和叶绿素降解关键酶编码基因ATACD1表达量显著上调。综上认为，大豆类受体蛋白激酶基因RLPK2参与调控植物叶片衰老进程，其表达对叶片衰老具有促进作用。

　　关键词：大豆RLPK2基因，叶片衰老，激发压，抗氧化酶，丙二醛

　　作为进行光合作用的主要器官，叶片的生长发育优劣直接影响作物的生长、产量及品质。叶片衰老是叶片生长发育进程中的最终阶段，它不是叶片细胞的简单死亡过程，而是一种主动的、受细胞内部遗传程序控制的、器官水平上动态的细胞程序性死亡过程，并且受到外部多种环境因素(光照、水分、温度、矿质元素和微生物)及内部发育信号(激素、遗传和基因调控)的协调控制(初梦圆和于延冲，2019)。此外，叶片衰老还与Ca2+、糖、活性氧(relativeoxygenspecies，ROS)水平和内源激素的变化等因素密切相关(张艺函等，2019)。叶片衰老主要表现为光合同化能力下降，细胞结构的退化，光合色素包括叶绿素和类胡萝卜素的降解，蛋白质和核酸降解，ROS与丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，水解酶及生长抑制因子持续增长等，这些特征在多种植物中已有描述(Wooetal.，2013;Wangetal.，2016)。葉片衰老能够增强植物对生存环境的适应性，从而有利于其生存和延续。但对农作物的生长而言，植物过早衰老引起的叶片同化功能的减退也极大地影响和限制了农作物产量潜力的发挥，导致作物品质及产量的损失。因此，对叶片衰老机理的研究不仅在揭示植物的生态适应等方面具有一定意义，还在粮食生产上抑制早衰具有重要意义。大豆在我国播种面积仅次于玉米、水稻、小麦和马铃薯，是第五大粮食作物，其含有丰富的植物蛋白质，同时又可用来榨油，因此是我国重要的油料作物。相关研究表明，叶片早衰严重影响着大豆正常的生长发育，并会引起产量及品质的下降(吕林涛，2018)。鉴定大豆叶片衰老相关基因及其功能对于提高大豆的优质高产和育种改良具有重要的科学意义和深远的应用价值。

　　植物类受体蛋白激酶(receptorlikeproteinkinase，RLKs)具有特殊的蛋白质结构，在植物中普遍存在，占植物蛋白激酶总量的60%，是植物中较大的基因家族之一，参与细胞信号转导途径过程，并在植物的生长发育和环境的适应过程中具有重要作用(Shiu&Bleecker，2001)。其中，富含亮氨酸重复序列(leucinerichrepeat，LRRs)型类受体蛋白激酶是RLKs中最大的一个亚家族(Coletteetal.，2011)。迄今为止，LRRsRLKs蛋白的结构特点和表达模式在拟南芥(阿依江·哈拜克等，2014)、烟草(曾建斌，2011)、花生(庄瑞蓉等，2018)、马铃薯(谢洁等，2019)等植物中均有研究。相关研究表明，LRRRLKs在植物整个生长发育过程中具有重要作用(Diévart&Clark，2004)。谢洁等(2019)发现马铃薯LRR类受体蛋白激酶SCLRRK1在低温条件下表达受到抑制，证实其参与低温胁迫响应过程。Zhou等(2016)发现LRRRLKs型基因调节拟南芥花药的发育过程。作为LRRRLKs家族中被研究较为广泛的一员，BAK1在油菜素内酯(BR)信号转导途径(Heetal.，2007)、植物先天免疫反应(韦莉等，2019)、细胞死亡调控(Zhouetal.，2019)等方面发挥作用。大豆RLPK2基因(GenBank登录号：AY687391)是植物分子遗传学研究组李小平副教授前期以大豆科丰34为材料筛选到的一个编码N末端富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶基因，前期研究结果发现人工诱导衰老处理显著提高了该基因在大豆初生叶片中的转录水平，初步分析显示该基因可能参与大豆叶片衰老的调控过程。本研究在此基础上构建了大豆RLPK2基因过表达载体并转化野生型拟南芥，对转基因拟南芥叶片衰老进程进行分析，进一步揭示该基因在植物叶片衰老中的功能，以期为延缓叶片衰老从而提高大豆作物产量和改善作物品质提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1材料及培养方法

　　本试验所使用的拟南芥(Arabidopsisthaliana)为哥伦比亚野生型(WT)拟南芥(Columbia0)。培养环境条件如下：温度为20～25℃，光暗周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为100SymbolmA@

　　mol·m2·s1，相对湿度为80%。

　　1.2总RNA的提取和反转录

　　采用QIAGEN的植物RNA提取试剂盒RNeasyPlantMiniKit按照操作说明提取大豆品种科丰34叶片总RNA，经微量紫外分光光度计(Merinton，美国)检测其纯度和浓度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，利用Thermo公司提供的cDNA试剂盒按照反转录说明书合成cDNA第一条链。

　　1.3RLPK2全长cDNA引物设计及RTPCR基因扩增

　　利用PrimerPremier5.0软件设计RLPK2基因的特异性引物，根据Gateway技术构建表达载体的要求，在引物5′端加上AAAAAGCAGGCTCG，引物序列如下：

　　RLPK2OXF：5′AAAAAGCAGGCTCGATGAGA

　　TCAGTAAGTTCCCCTG3′;

　　RLPK2OXR：5′AGAAAGCTGGGTTTTAATCT

　　CTCTTCTCCAAGTAAGAAG3′。

　　采用高保真PhusionDNA聚合酶进行PCR扩增。反应程序：94℃预变性30s，35个循环(94℃30s，62℃30s，72℃30s)，循环结束后72℃10min延伸反应，4℃保温。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收特异性目标条带，送样测序，选取测序正确的克隆进行后期载体的构建。

　　1.4RLPK2过表达载体构建、拟南芥遗传转化及纯合体筛选

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文章名称： 过表达大豆类受体蛋白激酶基因RLPK2促进转基因拟南芥叶片的衰老

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