刺参体腔细胞免疫相关基因对溶藻弧菌感染的响应

　　摘要：为探讨分离自患病刺参(Apostichopus japonicus)的一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染刺参后，刺参体腔细胞免疫相关基因的响应变化，分别给刺参注射100 μL生理盐水(对照组)和1×109 CFU/mL溶藻弧菌菌液(实验组)，用荧光定量PCR技术，检测24 h内刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达的变化。结果表明，注射生理盐水对刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达量无显著影响。感染溶藻弧菌后，实验组刺参体腔细胞中溶菌酶基因的表达量在24 h显著升高，且1 h和24 h时的表达量显著高于对照组(P<0.05);刺参体腔细胞中p105基因在感染后表达量呈上升趋势，3 h达到峰值，在3 h和6 h，p105基因的表达量显著高于对照组(P<0.05);刺参体腔细胞Rel基因表达量在感染后无显著变化。可见刺参感染溶藻弧菌后其体腔细胞Lys和p105基因的表达在短时间内迅速响应。

　　关键词：刺参(Apostichopus japonicus);溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);体腔细胞;基因表达

　　溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科，弧菌属，革兰氏阴性菌，是一种常见的海洋致病菌，对鱼、虾、贝等海水养殖动物都有较强的致病性[1-4]。溶藻弧菌会在侵袭和增殖过程中对机体造成细胞和组织损伤以及其代谢产物干扰和破坏机体的局部或全身的正常新陈代谢或机能[3-5]。卢芷程等[5]的研究结果表明溶藻弧菌感染凡纳滨对虾后会启动其免疫机制并产生活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)以对抗病原菌入侵，随感染时间的延长抗氧化系统会被激活。李晶晶等[6]在研究中也表明凡纳滨对虾感染溶藻弧菌后，需要不断保持较高的免疫水平，其体内的3种Toll样受体(Toll-like receptors)基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高。溶藻弧菌也是刺参病害的主要致病菌之一[7]，但关于其对刺参免疫的研究较少。刺参体腔细胞在刺参非特异性免疫中起着非常重要的作用，是其最基本的防御武器[8]。溶菌酶是刺参体腔细胞重要的免疫抗菌蛋白，其活性是表征机体对细菌性病原抵抗能力的重要指标[9]。核因子κB(NF-κB)信号通路是先天性免疫中最为重要的途径，Rel、p105是该信号通路上重要的转录因子，同时Rel、p105基因已在刺参上被成功克隆到序列[10]。因此本研究聚焦刺参体腔细胞的非特异性免疫，选取刺参体腔细胞溶菌酶(Lys)、Rel、p105基因为目标基因，探讨刺参体腔细胞对溶藻弧菌(从患病刺参体壁分离)刺激后24 h内Lys、Rel、p105免疫基因的响应，为进一步探究刺参抵抗溶藻弧菌感染的免疫机理提供基础参考。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物

　　实验所用刺参购买于东方海洋生物科技有限公司。选取平均体重为3 g的健康刺参200头，暂养于连续充气的水箱中，常规养殖管理，暂养1周。实验开始前将刺参分为实验组与对照组。

　　1.2实验菌株

　　实验菌株分离自患病刺参，经16S rDNA鉴定为溶藻弧菌。使用2216E培养基，28 ℃对其进行液体培养，培养过夜后，离心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)收集菌体，菌体用0.85%的生理盐水重悬，将细菌浓度调节至1×109 CFU/mL备用。

　　1.3溶藻弧菌的急性感染与样品采集

　　注射实验开始前，取18头刺参，每6头刺参的体腔细胞混在一起，作为一个重复，即为0时刻的样本。对照组每头刺参体壁注射0.1 mL生理盐水，多点注射。实验组每头刺参体壁注射0.1 mL浓度为1×109 CFU/mL的溶藻弧菌菌液，多点注射。注射后分别在1、3、6、12、24 h取样，每个时刻随机取18头刺参，解剖刺参获取刺参的体腔液，每6头刺参的体腔液混合在一起作为一个重复样本，每一时刻三个重复。体腔液转入离心管中，4 000 r/min，4 ℃离心，去上清，每管体腔细胞加入1 mL TransZolTM Up(北京全式金)，并用枪反复吹吸，使体腔细胞裂解，液氮速冻，转入-80 ℃冰箱保存，用于体腔细胞RNA的提取。

　　1.4免疫相关基因表达量的测定

　　1.4.1刺参体腔细胞RNA的提取取-80 ℃保存的刺参体腔细胞，按照TransZolTM Up Plus RNA Kit (北京全式金)试剂盒说明提取RNA。用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否被降解;用微量紫外分光光度计检测RNA的浓度。RNA-80 ℃保存备用。

　　1.4.2cDNA的合成和荧光定量PCR使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)试剂盒对刺参体腔细胞RNA进行反转录。向无RNAase的PCR管中依次加入500 ng模板RNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR、1 μL gDNA Remover，補足RNase-free Water 至20 μL。轻轻混匀，42 ℃孵育15 min。85 ℃加热5 s。得到的cDNA -20 ℃ 保存备用。

　　引物设计参考Wang等[10]、Yang 等[11]，由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)试剂盒操作说明，进行荧光定量PCR。扩增反应体系如下：Template 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 04 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、dd H2O 8.2 μL。PCR 程序为： 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s;56 ℃ 25 s;72 ℃ 25 s，共40个循环。以Cytb为内参基因，基因的相对表达量以 2-ΔΔ CT法进行计算[12]。

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文章名称： 刺参体腔细胞免疫相关基因对溶藻弧菌感染的响应

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