多粘类芽孢杆菌胞外多糖的功能研究进展

　　摘 要：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)属于芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，可以产生多肽类、蛋白类、酶类、功能性多糖及其他代谢活性物质。现代研究表明，多糖类化合物具有广泛的生理功能。随着研究的不断深入，多粘类芽孢杆菌胞外多糖已被证明具有抗氧化性、免疫活性、抗肿瘤性等功能，在生物医药领域及生态农业方面有着广泛的发展前景。该文综述了多粘类芽孢杆菌菌株来源及其胞外多糖的发酵工艺、提取、分离纯化、结构分析及功能方面的研究进展，并对其未来的发展研究进行了展望。

　　关键词：多粘类芽孢杆菌;胞外多糖;发酵工艺;提取;结构分析;生物活性

　　多粘類芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)是类芽孢杆菌的模式菌[1]。类芽孢杆菌属于革兰氏阳性好氧或兼性厌氧菌，能产生芽孢，抗逆性极强，在高酸、高碱、高寒、高盐的逆境下生长良好[2]。其细胞呈直杆状，菌落特征多成浅黄色或白色的黏稠状，表面湿润光滑;靠周生的鞭毛运动，膨大孢子囊中产生椭圆形芽孢;最适生长温度为28～35℃，最适pH7.0，能产酸，有时产气[3]。多粘类芽孢杆菌广泛存在于自然界中，多数在植物体内外及根际土壤中分离而来，作为一类重要的根际有益菌[4]，其具有促进植物生长和生物防治的作用，被广泛应用于农业领域。多粘类芽孢杆菌具有良好的生物学活性物质，如蛋白质类、多糖、多肽类、脂类[5]。近年来的研究表明，多粘类芽孢杆菌胞外多糖具有净化水质[6]，吸收废水中的重金属离子[7]等作用，在环境生态领域中具有重要的应用价值。此外，它还具有抗氧化性、抗肿瘤性、调节免疫等生物活性，在医药领域中有着重要作用。多粘类芽孢杆菌产胞外多糖在农药助剂方面也发挥着重要作用，包括助悬浮和热保护作用[8]。多粘类芽孢杆菌有多种生物学活性，对人畜安全和无污染，具有广泛的应用前景而受到青睐，美国环保署(EPA)将其列为可在商业上应用的微生物[9]。

　　胞外多糖作为一种生物材料的来源，近年来受到了越来越多的关注。微生物多糖具有生产过程可控性高、不受外界因素影响、生产周期短，具有独特的理化性质及生物活性等优势，已被广泛应用于各个领域。微生物多糖由范围极广的单糖构成，具有十分复杂的结构，其活性受发酵条件、提取工艺、纯度、含量等多因素的综合影响。因此，菌株发酵的条件及胞外多糖的提取、分离纯化对后续结构分析鉴定及其活性功能的研究尤为重要。在多粘类芽孢杆菌发酵过程中，会产生大量的胞外多糖，容易分离提取。本文综述了多粘类芽孢杆菌的来源及其多糖的提取工艺、纯化、结构分析及其功能进展，并对未来相关领域研究进行了展望，为多粘类芽孢杆菌胞外多糖的综合应用以及进一步研究提供参考。

　　1 菌株来源

　　多粘类芽孢杆菌在自然界中分布广，广泛分布于土壤、植物的体表以及根部，也是常见的植物内生菌。目前，多粘类芽孢杆菌多从植物的根际土壤中分离而来。刘训理[10]等从泰山土壤中分离得到1株对多种动植物病原细菌和真菌具有较强拮抗作用的多粘芽孢杆菌Cp-s316。陈雪丽[11]等从大豆根际土壤中分离得到多粘芽孢杆菌BRF-1。张道敬[12]等在番茄的根际土壤中分离得1株生防菌株多粘芽孢杆菌HY96-2。林茂兹[13]等从太子参根际土壤中筛选出对尖孢镰刀菌有很强抑制作用的多粘类芽孢杆菌S960。张宏福[14]等从中华芦荟中分离到1株植物内生菌多粘类芽孢杆菌A11，并且对该菌进行了全基因组测序。吴棣[15]等自中国贵州辣椒根际土壤中分离得一株具有良好的拮抗性能并具有较好的植物促生及溶磷、解钾的能力的多粘类芽孢杆菌SC2。鄂垚瑶[16]等从西瓜种植发病区健康植株根际分离得到的一株兼具促生及生防功能的根际有益菌多粘类芽孢杆菌SQR-21。李玉洋[17]等从水稻根际土壤中筛选得到1株对水稻恶苗病菌拮抗作用较强的多粘类芽孢杆SH15。王波[18]等从大豆植株中分离得到多粘类芽孢杆菌XZ-2。

　　2 发酵工艺

　　在发酵产胞外多糖的过程中，发酵培养基成分和发酵条件对胞外多糖的合成至关重要，通过优化培养基成分和发酵条件促进菌体生长及其生理代谢，是提高胞外多糖产量的重要手段，成为优化多糖生产工艺的研究热点。优化发酵工艺通常使用单因素试验、正交试验、响应面设计方法相结合，综合探究不同因素之间的交互作用。

　　2.1 培养基优化 培养基组分在很大程度上影响著微生物生长及其代谢产物的积累，适合菌体生长繁殖的培养基不一定适合于代谢产物的积累。不同的菌株对碳源、氮源、生长因子和无机盐离子等营养物质种类和浓度的要求大有不同，不同代谢物的产生对这些要求也不同。因此，为提高多糖产率，需对培养基成分进行优化。碳源不仅是微生物菌体的能源物质，也是合成菌体和目的产物的碳成分提供者。碳源对菌体产多糖的数量和质量起着关键作用。不同的碳源对微生物的生长及其多糖的合成有一定的影响。氮源是细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的组分，是菌体生长繁殖的必需营养素，为微生物生长提供营养所需的氮元素，也是合成多糖的重要成分，适宜的氮源及添加量有利于多糖的合成。无机盐及微量元素是微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，一般在低浓度有促进作用，在高浓度有抑制作用。不少研究表明，对于多粘类芽孢杆菌产多糖，蔗糖是最佳碳源。如刘俊等[19]先用单因素实验方法筛选影响胞外多糖的产量因子，再用响应面法对碳源、氮源和无机盐的培养基成分进行优化，最终确定最佳培养基组合为蔗糖188.2g/mL、酵母膏25.8g/mL、氯化钙0.34g/mL，其提取量高达35.26g/L。蹇华丽等[21]采用单因素实验法，以多糖产量为指标，对多粘类芽孢杆菌PS04发酵培养基成分进行优化，最终确定蔗糖是最佳碳源，最适浓度150g/L，最佳氮源为无机氮NH4NO3，最适浓度1.4g/L。王波[18]等采用单因素试验和正交试验相结合的方法对多粘类芽孢杆菌XZ-2的培养基组分进行优化研究，得出利用蔗糖发酵产糖量最高，其最佳培养基组成为蔗糖15g/L、蛋白胨15g/L、硫酸镁5g/L、氯化钙3g/L。

　　2.2 发酵条件优化 微生物的正常生长繁殖，需要适应的环境。在胞外多糖发酵生产中，除培养基的成分及浓度外，培养温度、初始pH、发酵时间、通气量、接种量等工艺条件也是主要的影响因素。只有将这些外界条件控制在适合菌种发酵的最优水平，才能提高多糖的产量。温度是影响微生物生长的重要因素，它会影响菌中的酶活性，进而会影响微生物体内所进行的各种生化反应，对微生物的影响是最为广泛的。在一定范围内，适宜的温度促进菌体生长，促进代谢活性物质的产生;不适的温度则会影响微生物的代谢。pH值也会影响菌中酶的活性，直接影响菌类的正常生长和代谢，pH过高或过低均会影响多糖产量。到目前为止，已有不少关于多粘类芽孢杆菌产多糖培养条件的报道。杨树丽[20]采用单因素试验法确定了类芽孢杆菌C-12菌株的最佳发酵条件为温度30℃，初始pH6.0，转速160r/min，接种量6%。蹇华丽[21]采用单因素法和响应面设计对菌株PS04发酵产多糖的工艺进行优化，最终得出初始pH值为8.22、发酵温度37℃、接种量4%、发酵周期48h时，多糖产量可达到60.04g/L，约为发酵条件未优化时产量的6倍。表明通过响应面设计方法对发酵条件进行优化可以明显提高多糖的产率。杨棒棒[22]等在类芽孢杆菌ZX-5产胞外多糖发酵条件优化中，先对碳源、氮源、温度、pH、碳浓度、氮浓度进行单因素试验，得出温度、碳源浓度、氮源浓度对产多糖具有显著影响，再选用这3个因素进行响应面试验，分析多糖产量的交互作用，得到最佳的产糖温度条件为20℃，在优化条件下产糖量达到34.55g/L，是基础水平的2.01倍。

　　3 提取与纯化

　　目前，微生物胞外多糖的提取一般采用离心除菌体、有机溶剂沉淀、去除蛋白、透析、冷冻干燥等步骤得多糖粗品，其纯度较低，常含有色素、蛋白质和小分子物质等杂质。杂质的存在不仅降低了多糖的纯度，也影响对其结构与生物活性的研究。利用凝胶柱层析、离子交换柱层析等手段进行纯化，可得到纯度较高的多糖样品。

　　3.1 提取 多粘类芽孢杆菌多糖为胞外产物，分离过程一般先要去除菌体。高速离心是除菌体最常用的方法。然而，多糖的高粘度性会使发酵液难于离心，因此，有研究者采用先稀释发酵液再离心的方法，也有研究者在处理发酵液前先加热发酵液[23]。加热会使结合在细胞壁上的多糖脱离细胞，同时使蛋白质变性沉淀[24]。因此，发酵液先经热处理，再冷却稀释离心更适合高粘度的多粘类芽孢杆菌发酵液中多糖的提取。用乙醇沉淀是最常用的多糖提取方式[25]。不同菌株发酵液中多糖的提取率与乙醇的浓度有很大影响。如贾杰[26]等用1倍体积的乙醇沉淀多粘类芽孢杆菌HY96-2胞外多糖。田文祥[27]等用3倍体积的95%乙醇沉淀多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖。有机溶剂在低温下可提高其沉淀量，促进沉淀速度，所以多数研究者使用有机溶剂时先经预处理再沉淀，或是在低温条件下进行沉淀。

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文章名称： 多粘类芽孢杆菌胞外多糖的功能研究进展

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