蒙古黄芪苗期立枯病害及其病原菌鉴定

　　摘要：为明确蒙古黄芪苗期立枯病害及其病原菌种类，采用组织分离法进行病原菌分离，并根据其培养性状、形态学和分子生物学rDNA-ITS特征进行鉴定。结果表明，该病害的病原菌为立枯丝核菌(Rhizotonia solani)。室内致病性测试结果表明，立枯丝核菌可引起蒙古黄芪苗期立枯病。本研究首次报道了蒙古黄芪苗期立枯病及其病原菌，可为生产上该病害的防治提供理论依据。

　　关键词：苗期;蒙古黄芪;立枯病;病原鉴定;致病性测定

　　引言

　　黄芪(Astragalus menbranaceus)是豆科黄芪属多年生草本植物，有蒙古黄芪(Astragalus menbranaceus var. mongholicus)和膜荚黄芪(Astragalus menbranaceus)[1]，以干燥的根入药，具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效[2]。蒙古黄芪原产于山西、内蒙、河北、陕西和甘肃等地。甘肃省陇西县是国内主要的道地黄芪产区之一，具有品质优和产量高等特点，被中国特产组委会命名为“中国黄芪之乡”。随着甘肃省黄芪人工栽培面积的逐年扩大、黄芪连作生长环境的改变和土壤病原菌数量的不断积累，黄芪病害已成为制约其产量增加和品质提升的重要因素之一。

　　关于黄芪的一些病害国内学者有研究。陈宏宇等[3]对黄芪根腐病的发病因素进行调查，结果发现，温湿度、土壤质地、茬口对黄芪根腐病的发生都有一定的影响，连作是黄芪根腐病发生的主要因素之一，轮作对根腐病的防治作用明显。据报道[4-9]黄芪根腐病的主要病原菌为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporium)、茄病镰孢菌(Fusariumsonali)、锐顶镰刀菌(Fusarium acuminatum)、芬芳镰刀菌(Fusarium redolens)、链格孢菌(Alternaria sp.)和Ilyonectria torresensis等。骆得功等[10]、陈泰祥等[11]和陈秀蓉等[12]对甘肃省陇西县几个重病区的黄芪霜霉病病原菌鉴定为黄芪霜霉菌(Peronospora astragalina)。任举[13]报道，黄芪叶部的锈病由单孢锈菌属(Uromyces)真菌引起。李绥峰[14]、孙树文等[15]、徐福祥[16]、邢占民[17]、周天旺等[18]和陈泰祥等[19]对黄芪白粉病的发生特点、发生规律、病原种类及防治进行了研究。马莹莹等[20]系统总结了黄芪主要病害的发生情况、致病菌种类的多样性、抗病品种选育、栽培管理模式、土壤營养、化学防治和生物防治等，为黄芪病害的综合防治提供了参考。关于立枯丝核菌引起的黄芪根病有报道，但由其引起的苗期黄芪立枯病未见报道。因此，笔者对定西市苗期发生的黄芪立枯病的发病症状进行研究，以确定其病原种类和致病性，为苗期黄芪立枯病的田间防治提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1病样采集及田间病害分级

　　在定西市农业科学研究院黄芪种植基地，采集苗期黄芪立枯病发病植株，记录采集信息后装入自封袋。采用5点取样法进行田间调查，每点30株。病害分级标准为：0级—根部无病斑，1级—根部病斑面积占总根部面积的1/4以下，3级—根部病斑面积占总根部面积的1/4～1/2，5级—根部病斑面积占总根部面积的1/2～3/4，7级—根部病斑面积占总根部面积的3/4以上。

　　1.2病原菌分离

　　采用常规组织分离法[21]，无菌条件下剪取病健交界处组织块5 mm×5 mm置于75%酒精中浸泡5 s，然后转移至1.5%次氯酸钠溶液中消毒1 min，无菌水漂洗3次晾干，置于PDA培养基平板内于25℃培养5～7天。将分离纯化的菌株转接至PDA斜面，4℃保存备用。

　　1.3病原菌形态学鉴定

　　将病原菌接种在PDA培养基上，25℃下培养7天后，观察并拍照记录菌落形态、颜色、产孢结构及孢子大小。根据魏景超[22]的分类方法和标准进行病原菌种类鉴定。

　　1.4病原菌分子生物学鉴定

　　1.4.1真菌基因组DNA提取刮取PDA培养基上的病原菌菌丝，按照真菌基因组DNA快速抽提试剂盒E.Z. N.A HP Fungal DNA Kit(OMEGA)的步骤提取DNA，保存于-20℃备用。

　　1.4.2分子鉴定的引物试验采用真菌核糖体基因ITS区域引物D1和D2，引物序列分别为ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4-R(TCCTCCG CTTATTGATATGC)。

　　1.4.3 PCR扩增、凝胶电泳、测序及序列分析PCR扩增体系(20μL)：2×Taq PCR SuperMix 10μL，10μmol/L正反向引物各1μL，DNA模板1μL，用ddH2O补足至20μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min;94℃变性20 s，50℃退火10 s，72℃延伸30 s，35个循环;72℃延伸2 min，4℃保存备用。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

　　1.4.4 rDNA序列比较分析与系统发育树使用BioEdit校对测序结果并拼接序列。测序后的序列经校正后，在核酸序列数据库GenBank(http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/)中进行同源序列搜索，比较测试菌株与数据库中相应序列的相似程度，获得同源性较高的立枯丝核菌ITS序列，应用DNAMAN进行序列比对分析，并用Mega 6.0 Neighbor-joining法构建系统发育树。

　　1.5病原菌致病性测定

　　采用柯赫氏法则进行致病性测定，将灭菌土装入高和直径都为15 cm的花盆中，挑选大小一致且无病斑的黄芪苗3株移栽，共移栽6盆。待黄芪茎秆长至6 cm时拨开花盆上部8 cm土壤，将分离纯化的病原物打成10 mm菌饼，分别做针刺和无刺伤接菌，以未接菌PDA培养基为对照，每株接1个菌饼，回填土壤浇水。50天后调查发病情况，同时将发病部位再次分离培养，通过形态学和分子生物学鉴定确定分离得到的病原菌与初接病原菌是否为同一病原菌。

　　2结果与分析

　　2.1发病症状

　　田间调查发现，苗期黄芪立枯病在6月上旬发病，8月进入发病盛期。地上部发病植株长势衰弱，叶色灰绿，失水状，少数叶片枯萎，提前脱落(图1a)。根茎部产生不规则形黑褐色网状病斑，围绕整个根茎，病斑不凹陷(图1b)。

　　2.2形态学鉴定特征

　　在PDA培养基上(图2a～b)，菌落初为白色，逐渐变为淡褐色至深褐色，菌落中间较密，边缘稀疏。3～4天形成“菌核”，菌核初为白色，后变紫褐色至深褐色。初生菌丝无色，粗细较均匀，直径4.98～8.79μm，分枝呈直角或近直角，分枝处大多有缢缩(图2c)，附近生有一隔膜。

　　2.3核糖体rDNA-ITS序列分析

　　测序结果与GenBenk数据库中进行Nucleotide Blast比对，与立枯丝核菌的ITS片段同源性达100%。用Mega 7.0软件，采用邻接法构建系统发育树，黄芪立枯病与Rhizoctonia solani亲缘关系最近(图3)。结合形态学和分子生物学特征，将引起黄芪立枯病的病原菌鉴定为立枯丝核菌(R. solani)。

　　2.4致病性测定

　　室内致病性测试结果(图4)表明，接菌植株表现出与自然病株相同的症状，未接菌植株表现正常，从接种发病黄芪植株上全部分离到病原菌，形态学和分子生物学鉴定为立枯丝核菌。

　　3讨论

　　植物病害病原种类的确定是防治的前提和基础，明确病原种类对制定合理的防治策略和提高防治效果有重要的指导作用。本试验首次报道了苗期黄芪立枯病的发病症状，同时明确了该病害的病原菌为立枯丝核菌。

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文章名称： 蒙古黄芪苗期立枯病害及其病原菌鉴定

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