海南槟榔黄化植原体分子检测及其系统发育关系研究

　　摘 要：由植原體引起的槟榔黄化病是海南特色经济作物槟榔种植上的一种毁灭性病害。本研究通过PCR扩增测序、序列多重比对和系统发育分析，对海南部分代表性地区槟榔致死性病原植原体的序列信息与系统发育关系进行检测分析。结果表明：本研究检测的保亭、屯昌、万宁等海南部分代表性地区的槟榔黄化植原体的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA与16SrI组植原体同源性为100%。序列多重比对分析表明，本研究各槟榔黄化植原体株系与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝和日本洋葱黄化、美国翠菊黄化等植原体同源性为100%;与已报道的海南万宁、印度、海南三亚的槟榔黄化植原体16S rDNA序列同源性分别为99.9%、99.9%、99.8%。系统发育分析表明，本研究槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等株系聚于一个分枝，支持率为100%。此外，在发病槟榔叶片、花穗、心叶等组织部位均可检测到植原体。研究结果表明，海南槟榔黄化植原体与海南苦棟丛枝、长春花绿变、马松子变叶、辣椒黄化皱缩、蛇婆子丛枝、细圆藤丛枝等植原体株系的同源性极高，槟榔黄化病很可能会以这些寄主植物作为病原传播载体进行传播扩散。

　　关键词：植原体;槟榔黄化病;分子检测;亲缘关系;传播载体

　　植原体(phytoplasma)是一类寄生于植物韧皮部通过刺吸式口器昆虫传播的植物毁灭性病原菌，1967年由日本学者土居养二首次发现[1]。植原体很难从植物或昆虫寄主中分离纯化培养，对其遗传信息及表达代谢等了解相对不足，严重制约植原体研究[2-3]。植原体引起的病害寄主种类多、分布范围广、危害程度大，对社会经济、生态环境等影响严重，该病害目前尚无有效的治疗药剂，以防為主。海南省植原体病害种类十分丰富，约占我国已鉴定植原体病害的五分之一，海南植原体病害遍及整个海南岛且危害程度严重，给海南省农林业造成巨大损失[4]。海南省受植原体病害影响的作物有槟榔(Areca catechu L.)、花生(Arachis hypogaea)、苦楝(Melia azedarach)、长春花(Catharanthus roseus)、辣椒(Capsicum annuum)、细圆藤(Pericampylus glaucus)、山黄麻(Trema tomentosa)等海南特色经济作物或绿化植物，对海南的社会经济和生态环境等造成严重的影响[4-8]，其中槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease， AYL)在海南发生普遍且严重，影响巨大。

　　槟榔是我国“四大南药”之首和海南省重要特色经济作物，具有很高的药用价值和经济价值。由植原体引起的槟榔黄化病是海南槟榔种植上的一种毁灭性病害，对海南的社会经济和生态环境造成严重影响。海南槟榔黄化病于1981年首次发现于屯昌县，目前已由发病初期的屯昌县蔓延至海口、文昌、琼海、万宁、陵水、琼中、定安、乐东、保亭、三亚、五指山等多个市(县)[4， 9]。金开璇等[10]通过超薄电镜切片在槟榔黄化病染病组织中观察到了植原体。车海彦[4]、罗大全等[11]、通过超薄电镜切片观察、四环素注射处理、PCR扩增检测等技术进一步证实植原体是海南槟榔黄化病的病原。近年来，在海南不同槟榔种植区均有不同程度的发生，且发病地区及面积仍在不断扩大，严重影响海南槟榔产业的健康可持续发展[4， 9]。目前，海南植原体病害的发生传播、扩散流行等问题尚不清楚，海南不同县(市)、不同生境、不同发病区植原体的来源、传播途径等问题尚不明确，这些问题严重制约海南相关植原体病害的防控管理。

　　本研究对海南不同代表性地区的槟榔黄化病进行调查，采集槟榔黄化病及疑似植原体引起的其他植物病害样品，通过PCR扩增检测、序列多重比对、系统发育分析等技术方法，从分子水平上对海南槟榔黄化植原体进行检测鉴定，丰富对槟榔黄化植原体分子水平上的认知。对本研究中槟榔黄化植原体与前期已报道的槟榔黄化植原体及亲缘关系或地理分布密切相关的植原体株系间的系统发育关系进行分析，揭示不同寄主植原体株系间遗传变异水平和系统发育关系。为槟榔黄化病在海南的传播扩散、流行监测和科学防控等研究提供科学参考，以促进海南该类病害防控理念的发展与提升。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 样品采集 实验材料于2019—2020年采自海南保亭、屯昌、万宁等地疑似槟榔黄化植原体引起的槟榔黄化病植株，每个地点采集3份叶片样品;针对同一株发病槟榔，采集叶片、花穗、心叶、茎皮、根等不同组织部位，每个组织部位采集3份样品，同时采集健康的槟榔样品作为对照，用作阳性对照的泡桐丛枝植原体样品取自中国林业科学研究院，所采样品低温保存备用。

　　1.1.2 试剂 植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、2×PCR Master Mix预混液、50×TAE、SYBR Green I染料、6×Loading Buffer、DNA分子量标准DL2000购自天根生化科技(北京)有限公司，其他试剂均为国产分析纯。PCR扩增引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 总DNA提取 叶片、花穗、心叶、茎皮、根等样品取样量均为0.1 g，利用CTAB法提取染病槟榔组织中的总DNA，植原体总DNA提取方法参考天根植物基因组DNA提取试剂盒说明书方法。

　　1.2.2 PCR扩增测序 槟榔黄化植原体通过植原体通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2[2]进行扩增。用引物R16mF2/R16mR1扩增的PCR产物稀释50倍后用作引物R16F2n/R16R2进行巢式PCR扩增的模板，引物序列信息见表1。PCR反应体系和条件如下：PCR反应体系为25 μL，包括1.0 μL DNA模板，1.0 μL上游引物和下游引物(10 μmol/L)，12.5 μL 2×PCR Master Mix(包含0.05 U/μL Taq DNA聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs)，用ddH2O补至25 μL。反应条件为94.0 ℃，5 min;94.0 ℃，30 s，53.0 ℃，40 s，72.0 ℃，1 min 30 s(直接PCR)或1 min 20 s(巢式PCR)，共35个循环;72.0 ℃，10 min。PCR扩增产物用SYBR Green I染色、经1.0%(w/V)琼脂糖凝胶、凝胶成像系统检测。相关PCR扩增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶检测，有明显目的条带的扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。本研究所得核苷酸序列均上传至GenBank数据库。

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文章名称： 海南槟榔黄化植原体分子检测及其系统发育关系研究

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