基于高通量测序的中国水仙根际土壤微生物群落组成

　　摘要：【目的】明確中同水仙植株根际土壤微生物群落的组成特征。【方法】采用Illumina Miseq高通量测序技术对水仙根际土壤微生物样品的保守基因区进行测序及生物信息学分析，阐明中同水仙根际土壤的细菌、真菌和^菌群落结构组成，并对水仙根际土壤微生物的优势菌属进行深入分析。【结果】共获得优化序列175840条，基于97%序列相似度，聚类为2 680个OTUs。优势细菌类群是绿弯菌门Chloroflexi( 30.86%)和变形菌门Proteobacteria(20.67%)，真菌以子囊菌门Ascomycota(84.94%)为主，属水平上球毛壳菌Chaetomium globosum( 28.15%)和散子囊菌Eurotiales( 25.01%)占较高比例。占菌类群主要为奇^菌门Thaumarchaeota( 51.40%)、深^菌门Bathyarchaeota(25.98%)和广古菌门Euryarchaeota( 20.65%)。其中，来自奇古菌门的SCG类群(25.67%)和嗜酸性氨氧化古菌Candidatus Nitrosotalea( 12.93%)占较高比例。【结论】中国水仙根际土壤微域具有丰富多样的微生物类群，这对于开发和利用水仙根际土壤微生物资源具有重要意义。

　　关键词：中国水仙;根际土壤微生物;高通量测序;细菌;真菌;^菌

　　引言

　　【研究意义】中国水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem.)是石蒜科多年生草本植物，原产我国，已有一千多年栽培历史，独具天然丽质，芬芳清新，素洁幽雅，是我国十大观赏名花之一，观赏价值极高，在园林造景中也有广泛应用。近年来，很多研究揭示了植物根际一土壤一微生物之间的相互作用机制，探明中国水仙根际土壤微生物群落分布特征对于解析中国水仙的生态生存机制具有重要意义[1-3]。但目前对中国水仙根际土壤微生物群落组成的认知仍然有限，尤其对水仙根际土壤真菌和古菌的群落水平鲜有报道，从而不能深入解析水仙根际土壤微生物與水仙生长发育的关系。【前人研究进展】水仙根际土壤微生物组成与栽培方式、地理位置及水仙的生长习性等密切相关[4]。体外喷施有效微生物群制剂，可显著促进水仙花的生长发育[5]。已有研究证实，大量微生物类群具有促进植物生长的机制。Ryu等[6]从拟南芥根际土壤鉴定出2种菌株，它们释放出的一些挥发性物质极大促进了拟南芥的生长。此外，从芽孢杆菌属、假单胞菌属和黄杆菌属中，分离到多种可增强植物抗病性的促生菌菌株[7-9]。根际土壤微生物也包括可以抑制植物生长甚至导致植株死亡的根际“有害菌，”如根腐病病原菌[1O]、青枯病病原菌[11]等，它们普遍分布在根际土壤环境中，略微积累，就有可能影响根际土壤微生物群落的稳定，产生有害物质，抑制植物根系对土壤养分的吸收，严重可导致植物死亡。根际环境成为土壤一根系一微生物互作的关键区域，被称作植物的第二基因组[12]，根际土壤微生物影响着植物的生长发育，近年来一直是科学家们研究的热点。【本研究切入点】福建省漳州市具有栽培水仙花的得天独厚的地理环境，可提供研究水仙根际土壤微生物群落结构、功能及其与植物互作的理想土壤材料。然而水仙根际土壤菌群结构的组成特征及根际细菌、真菌和古菌的关键微生物类群组成亟待深入探讨。【拟解决的关键问题】采集在漳州培育的漳州水仙根际土壤，利用高通量测序技术，对根际土壤中细菌、真菌和古菌群落的组成进行系统鉴定，分析水仙根际土壤环境中优势的微生物类群，并对其生物功能进行探讨，以期揭示中国水仙根际土壤微生物的群落分布特征，为解析水仙花的环境适应性机制以及建立科学合理的水仙花种植制度提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1根际土壤微生物样品采集

　　土壤样品于2020年4月25日在福建省漳州市“水仙花海”园区进行漳州水仙金盏银台根际土壤的采集。用5点取样法采集水仙根际土壤，去除土壤表层杂草和凋落物，在水仙植株的根部一侧小心挖掘，待改侧植株根系露出后，用毛刷刷取黏附在根表面的土壤。共采集5处样地的水仙根际土壤，每处样地选择3株植株，每处土样总采样量约为50 g，各样点土壤混匀后，封入灭菌的50 mL离心管，置于冰盒带回实验室。约20 g新鲜土样用于根际土壤核酸样品提取，剩余部分置于通风橱中，静置24h，磨细后过0.25 mm筛，用铝箔纸收集，用于土壤理化性质测定。

　　1.2土壤理化性质测定

　　用梅特勒一托利多pH计测定土壤pH;土壤有机质含量采用重铬酸钾( K2Cr207)法测定[13];土壤的全氮含量采用凯氏定氮法测定[14];采用碱解扩散法[15]、NaHCO，浸提法[16]和醋酸铵浸提一火焰光度法[17]测定土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量。采用乙酸铵离心法测定土壤阳离子交换量( Cation ExchangeCapacity，CEC)[18];用梅特勒一托利多电导率仪测定土壤电导率;采用石墨炉原子吸收光谱法测定土壤中铅( Pb)含量[19]。

　　1.3 DNA抽提和PCR扩增

　　根际土壤微生物DNA样品依据PowerSoil?DNAIsolation kit( MoBio.U.S.)说明书的操作进行，DNA的质量、浓度和纯度通过1%的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000鉴定;使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[20]对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增;使用524FlOextF(5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')和Arch958RmodR(5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3，)[21]对古菌16S rRNA基因的特异区间进行PCR扩增;使用SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ')和1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3，)[22]对真菌18S rRNA基因的特异区间进行PCR扩增。扩增程序如下：95℃3 nun，35个循环(95℃30 s，58℃30 s，72℃30s)，72℃15 min，最后4℃保存(PCR仪：ABI Verity? 96型)。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu 4 uL，2.5 mmol·L-l dNTPs 2 uL，上游引物(5umol·L-l) 0.8uL，下游引物(5 umol·L-I) 0.8 uL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 uL，模板DNA 10 ng，使用灭菌双蒸水将体系补足至20 uL。每个样本设置3个重复。

　　1.4 Illumina Miseq测序

　　使用2%琼脂糖凝胶分离PCR产物，然后对相应胶条进行切割回收，利用MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit( TaKaRa，Japan)进行回收产物纯化，并用QuantusrM Fluorometer( Promega，USA)对回收产物进行检测定量。建库依据NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit进行，具体步骤如下：①在DNA片段两端连上特定序列的接头;②利用样品本纯化磁珠进行片段筛选;③通过PCR扩增实现原始模板的富集;④将PCR扩增后的文库进行分选回收。采用Illumina Miseq测序技术(上海美吉生物医药科技有限公司)对文库进行高通量测序分析。原始数据上传至NCBI SRA数据库(序列号：SAMA16825444，Genbank登录号：PRJNA679159)。

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文章名称： 基于高通量测序的中国水仙根际土壤微生物群落组成

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