罗汉果土传病害拮抗细菌的筛选及鉴定

　　摘要：【目的】從罗汉果根际土壤中筛选分离出对白绢病(southern blight)与根腐病(root rot)有抑制作用的拮抗细菌，为罗汉果土传病害生物防治提供合适菌株。【方法】采用稀释涂布法和划线法从罗汉果果园土壤中分离纯化出拮抗细菌114株。随后对分离出的拮抗细菌采用平板对峙法进行抑菌活性筛选。通过16S rDNA序列分析，结合菌落形态特征，生理生化特征对菌株进行鉴定。【结果】22株细菌对至少1种罗汉果土传病原真菌表现出小同程度的抑制作用。其中5株细菌即TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7和TYX-8对根腐病与白绢病抑制作用最为明显，对罗汉果根腐病菌的抑制率分别为67.53%、57.50%、64.17%、60.00%和66.67%。对罗汉果白绢病菌的抑制率分别为83.03%、87.58%、53.3 1%、82.27%和86.67%。经过形态学、生理生化特征以及16S rDNA系统发育树的分析，确定TYX-2、TYX-7和TYX-8为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezia)，TYX-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，TYX-4为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。贝莱斯芽孢杆菌TYX-2、枯草：芽孢杆菌TYX-3和解淀粉芽孢杆菌TYX-4发酵液对2种罗汉果病原真菌电有较好的抑制作用，对罗汉果根腐病菌的抑菌率分别为47.83%、48.67%和45.83%，对罗汉果白绢病菌的抑菌率分别为5 2.00%、50.42%和55.83%。【结论】分离鉴定出的TYX-2、TYX-3和TYX-4分别为贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，具有较高的生防应用价值，为进一步研制复合生防菌剂，防治罗汉果土传病害奠定理论基础。

　　关键词：罗汉果;根腐病菌;白绢病菌;分离鉴定;拮抗细菌

　　引言

　　【研究意義】罗汉果Siraitia grosvenorii (Swingle)C.Jeffrey为葫芦科Cucurbitaceae罗汉果属Siraitia多年生草质藤本宿根植物，又名汉果、长寿果、神仙果，是我国特有甜料及珍贵药用植物。罗汉果果实富含人体所需的多种氨基酸、维生素及多种糖类物质，具有清心润肺、止咳消喘、清热解毒、润肠通便、祛痰补血、益肝、健脾、镇静及降压等功效，已被广泛应用于医药、保健品、饮料和调味品等领域[1]。罗汉果的药用部位不仅是果实，根和叶也可入药，对治疗消化系统疾病，降低血压功效显著;罗汉果甜素具有甜度高，不含热量，无毒等优点，符合目前食品市场对低热量甜味剂的需求，在保健食品领域发展前景广阔[2]。

　　但以白绢病、根腐病为主的罗汉果土传病害严重影响果实产量。仅2003 2005年桂林罗汉果种植区因病害死亡共计234789株，经济损失达586.97万元。白绢病病菌能危害100多科的500多种植物，主要通过侵染植物幼苗近地面的根茎部发病[3]，发病植株根部产生白色菌丝持续蔓延，在后期可形成褐色菌核。罗汉果根腐病发病症状表现在地上、地下2个部分。地下部分：须根少并完全腐烂，主根呈黑色逐渐腐烂。

　　地上部分：植株矮小，底叶变黄枯落，最后整株叶片萎蔫、枯死[4]。土传根系病害发生除与病原菌有关外，还常伴随根际土壤微生物区系异常，有害微生物数量增加，有益微生物数量减少，严重影响植物健康[5]。因此，如何全面有效地防治这类土传病害已经成为植物生产上的当务之急。【前人研究进展】拮抗菌的筛选鉴定是植物生物防治中的关键环节。有研究表明从健康草莓根际土壤中分离出的多粘类芽孢杆菌可使草莓根腐病菌尖孢镰刀菌菌丝畸形生长[6]。Sid Ahmed等[7]从甜椒根基组织中分离出4株芽孢杆菌，可有效降低疫霉菌侵害，与对照组相比根系腐烂情况降低80%。

　　季倩茹等[8]将巨大芽孢杆菌B213、多粘类芽孢杆菌B207和枯草芽孢杆菌B204 3种芽孢杆菌联合施用后在盆栽实验中可有效抑制黄瓜枯萎病的发生。这些研究结果表明从植物根系土壤中分离鉴定的拮抗菌具有良好的生防效果，在生物防治中发挥重要作用。【本研究切入点】目前生防微生物的研究多集中在辣椒、草莓等大面积种植的作物，对罗汉果土传病害拮抗菌的研究较少，因此本研究从健康罗汉果根系土壤中分离纯化拮抗细菌，对其进行抑菌效果测定，对效果较好的菌株进行鉴定并探究其发酵产物活性。【拟解决的关键问题】筛选出的拮抗菌株，进一步开展利用拮抗微生物防治罗汉果土传病害的研究，旨在探讨有效的罗汉果土传病害绿色防控新技术，解决目前该类病害危害严重、防治困难以及因化学防治造成的罗汉果产品农药残留问题，为罗汉果产业的健康可持续发展提供有效的技术支持。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　病原菌：腐皮镰孢菌(Fusarium solani)，罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)均从桂林市临桂区罗汉果种植园内采集具有罗汉果根腐病与白绢病典型症状的病株中分离得到。

　　拮抗细菌：从桂林市临桂区罗汉果种植园内健康罗汉果根际土壤中分离得到。

　　LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，去离子水1000 mL，pH 7.0。

　　LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，用去离子水定容至1000 mL，pH 7.0。

　　牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：牛肉膏3 9，蛋白胨10 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

　　PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。

　　1.2试验仪器

　　主要仪器：超净工作台ZHJH-C1112C，上海智城;恒温培养箱，韶关泰宏医疗器械;恒温摇床LY2-2102C，上海龙跃;紫外可见光分光光度计UV-1200，上海美普达。

　　1.3试验方法

　　1.3.1土壤拮抗细菌的分离 选取自然状态下生长较为粗壮的罗汉果苗，缓慢抖落根部土壤后取附着在根际表面的土壤，参考柳慧丽[9]的方法，将10 g健康罗汉果根际土壤样品放入装有90 mL无菌水的250 mL灭菌三角瓶中，将三角瓶置于37℃，200r·mm_1摇床振荡20 min，使之充分悬浮后在80℃水浴条件下加热10 min后用无菌水稀释至10-3、10-4、10-5、10 6等4个浓度梯度。分别吸取100 uL土壤悬液用涂布法接于牛肉膏培养基上，每种浓度梯度重复3次，置于30℃培养箱培养24-48 h，定时观察并挑取单菌落进行平板划线纯化。将平板置于4℃冰箱内保存。

　　1.3.2土壤拮抗细菌对罗汉果土传病原真菌的抑菌活性测定 采用平板对峙法测定土壤细菌对罗汉果根腐病菌和白绢病菌的抑菌活性。在无菌操作台内用直径为4 mm的打孔器在恒温28℃，培养3d的病原菌落边缘打孔，用无菌接种针将菌饼接于PDA平板中央，同时在病原菌两侧2.5 cm处用接种环取分离菌株划线，对照组只接病原菌而不接种拮抗细菌( CK)。每个处理重复3次。28℃恒温培养，培养7d后测量病原真菌菌落半径，计算抑菌率[1O]。

　　抑菌率/% -[(对照菌落半径处理菌落短半径)/(对照菌落半径0.2 cm)]×100

　　1.3.3拮抗菌株鉴定 形态观察：将活化后的菌株用划线法接入平板，30℃培养24h，观察菌落的生长情况、颜色和形态特征。生理生化检测：将筛选的拮抗菌于LB液体培养基30℃培养24h后用于生理生化的测定，测定指标包括革兰氏染色、VP( Voges-Proskauer)实验、接触酶实验、吲哚产生实验、明胶液化实验、甲基红实验、阿拉伯糖发酵实验、甘露醇发酵实验、麦芽糖发酵实验、木糖发酵实验、葡萄糖发酵实验、蔗糖发酵实验。具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[11]。分子鉴定：采用细菌通用物27f： AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R： TACGGYTACCTTGTTACGACTT对其进行PCR扩增。反应体系30 uL。PCR扩增反应条件为95℃5 min. 95℃30 s，55℃30 s，72℃1min，35个循环，72℃10 min，12℃终止反应。送至北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行检测纯化及测序。登录NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)利用Blast软件将获得基因序列与GenB ank中已知的序列进行同源性比对分析，选择同源性相近的序列进行系统进化分析，序列先进行多重比对，然后用MEGA6软件采用邻接法(Kimura's 2-parameter模型，bootstrap 1000)构建系统发育树，明确拮抗菌株的系统发育学地位。

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文章名称： 罗汉果土传病害拮抗细菌的筛选及鉴定

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