苦瓜枯萎病原菌的绿色荧光蛋白基因标记

　　摘要：【目的】苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momodicae)侵染引起的一种重要土传病害。为有效防控该病害，对其病原菌进行绿色荧光蛋白基凶(gfp)标记，为研究病原菌在苦瓜植株体内的侵染特性提供可视化跟踪检测手段。【方法】采用农杆菌介导的遗传转化方法对苦瓜枯萎病原菌强致病性野生型菌株FJAT-3018进行绿色荧光蛋白基凶(gfp)标记，通过对转化子的菌落形态观察、生长速率和致病性测定，筛选出遗传稳定的转化子。【结果】野生型菌株FJAT-3018的转化效率约为14.5个转化子/106个孢子。经10次继代培养，筛选获得的转化子在菌落形态、生长速率和致病性方面与野生型菌株FJAT-3018无明显差异，gfp基凶在转化子的菌丝体和分生孢子中均能强表达;通过激光共聚焦显微镜扫描跟踪发现，转化子能够在苦瓜植株根部和茎部侵染与定殖。【结论】绿色荧光蛋白基因已成功转入到苦瓜野生型菌株FJAT-3018中，其转化子具有良好的遗传稳定性且致病力不受影响。

　　关键词：苦瓜;枯萎病;绿色荧光蛋白;基因标记

　　0引言

　　【研究意义】苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Momodicae)侵染引起的一种毁灭性土传病害，该病害在苦瓜整个生育期均可发生，并导致植株萎蔫死亡，造成产量损失，严重制约了苦瓜产业的发展[1-2]。为有效防控该病害，亟需了解该病原菌对苦瓜的侵染特性。因此，建立一种可视化的跟踪标记手段，有助于深入研究该病原菌的侵染过程和指导该病害防控。【前人研究进展】绿色荧光蛋白标记基因(gfp)可为研究病原菌在植株体内的侵染蔓延提供可视化跟踪技术[3]。它具有荧光性质稳定、直观、操作方便和不需要添加外源底物就可以在活细胞中直接检测等优点，已被广泛应用于真菌分子生物学研究[4-5]。适用于镰刀菌属真菌的gfp基因转化方法有多种，如PEG介导法、农杆菌介导法和基因枪介导法等[6-8]。其中农杆菌介导的转化方法是直接以真菌孢子或菌丝为受体，较PEG介导法和基因枪介导法的操作更简单，可减少转化过程中其他因素的影响，且转化效率和遗传稳定性也更高[9]。【本研究切入点】目前，国内外学者已利用gfp基因成功标记了番茄、香蕉、甜瓜和玉米等寄主作物尖孢镰刀菌[10-14]，但未见苦瓜枯萎病原菌的gfp基因标记的研究报道。【拟解决的关键问题】为有效防控该病害，采用农杆菌介导的遗传转化方法对苦瓜枯萎病原菌强致病性野生型菌株FJAT-3018进行绿色荧光蛋白基因(gfp)标记，并比较转化前后菌株的菌落形态、生长速率和致病性差异，筛选m遗传稳定标记的转化子，有助于通过可视化跟踪观察深入研究该病原菌的侵染过程和指导该病害防控。

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　苦瓜枯萎病原菌强致病菌株FJAT-3018属于尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.Momodicae)，由本研究室保存;供试苦瓜感病品种(新翠)植株购自厦门如意种苗高科技股份有限公司;农杆菌AGL-1菌株由中国农业大学惠赠，载体pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp由福建省农业科学院作物研究所提供;潮霉素B、卡那霉素、特美汀等抗生素均购白美国Sigma公司;PDB培养基(200g马铃薯，15g葡萄糖，加水定容至1000 mL);PDA固体培养基(200g马铃薯，15g葡萄糖，15g琼脂粉，加水定容至1000mL)，筛选培养基(含终浓度为100μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA固体培养基);农杆菌介导转化所需的试剂及3种培养基配方(基础培养基、诱导培养基和共培养培养基)参考文献[15]，具体配方见表1。混合纤维微孔滤膜(購白上海生工).0.22μm微孔过滤器(Millipore)。

　　1.2苦瓜枯萎病菌的绿色荧光蛋白基因转化

　　采用农杆菌介导法进行苦瓜枯萎病菌的gfp基因转化，转化方法参照文献[15]，略做改动。具体步骤如下：(1)苦瓜枯萎病原菌菌株FJAT-3018于含200μg·mL-1硫酸链霉素的PDA固体培养基纯化培养7d，在培养皿中加入适量无菌水，用无菌涂布棒刮洗菌落表面洗出分生孢子，孢子悬浮液用双层无菌擦镜纸过滤，并用诱导培养基调整分生孢子浓度为1×106个·mL-1备用。(2)将已转入pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp载体的农杆菌AGL-1用基础培养基(MM培养基)于28℃、250r·min-1摇床培养48h，后用诱导培养基(IM培养基)调整菌液浓度为OD600=0.15，继续摇床培养约6h至菌液OD600约为0.60。(3)将灭菌的混合纤维微孔滤膜放置在共培养培养基(CM培养基)上，并取已制备好的FJAT-3018孢子悬浮液和农杆菌液各100μL混匀后于混合纤维微孔滤膜上均匀涂布，10个重复，并于25℃暗培养48h。(4)共培养48h后，将混合纤维微孔滤膜用无菌刀片划成小块分散摆放到筛选培养基(含终浓度为150μg·mL-1潮霉素B和200μg·mL-1特美汀的PDA培养基)上，于28℃暗培养72h。(5)筛选培养基平板放置在BD-BGC1蓝光切胶仪中，挑取发出明亮绿色荧光菌落边缘的菌丝体于筛选培养基上复筛，继续用蓝光切胶仪挑选出发出明亮绿色荧光的平板，并通过单孢分离法获得相对应转化子。

　　1.3转化子的遗传稳定性检测

　　单孢分离纯化获得的强绿色荧光表达的不同转化子在PDA培养基上，28℃培养6d后，选取菌落边缘菌丝转接到新的PDA培养基上继续培养，重复以上方法连续培养10代，观察各转化子的菌落形态变化，测量菌落生长速度，以野生型菌株FJAT-3018为对照。挑取荧光强且遗传稳定的转化子于-80℃甘油冷冻保存，同时挑取代表性转化子的菌丝体制成玻片，置于荧光显微镜下观察菌丝和孢子的荧光强度。

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文章名称： 苦瓜枯萎病原菌的绿色荧光蛋白基因标记

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