枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的优化

　　摘 要：枯草芽孢杆菌HS09具备较好益生菌性能，已作为微生态菌剂应用于水产养殖业。为了提高菌株HS09产芽孢发酵水平，以芽孢产量为指标，通过单因素试验及正交试验对枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的碳源、氮源进行筛选及优化，确定最佳发酵培养基。结果表明：影响枯草芽孢杆菌HS09芽孢产量的主次因素为玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵优化培养基为葡萄糖10 g·L-1、硫酸铵8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1、硫酸锰0.5 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1 、磷酸二氢钾2 g·L-1、碳酸钙3 g·L-1;以最佳产孢发酵培养基进行200 L发酵罐放大发酵，发酵有效菌落数可达4.3×109 cfu·mL-1，实现芽孢90%高转化率。该研究结果可为菌株工业化生产提供参考依据。

　　关键词：枯草芽孢杆菌;培养基;优化;正交试验

　　枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是芽孢杆菌属的一种腐生细菌，由于发酵能够产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等十几种酶[1]，是重要的微生态益生菌。我国水产养殖业高速发展，但近年来水产养殖业在养殖密度和规模不断扩大的同时，也面临着日益严峻的食品安全问题。传统的抗生素虽然在治疗动物疾病、促进动物生长方面有明显优势，但其负面效应也日益突出，表现为病原微生物产生耐药性、不易降解等缺点，从而危害人类健康。因此，抗生素替代品益生菌、酶制剂等产品成为绿色饲料添加剂的热点[2-3]。微生态制剂作为抗生素的替代物之一，因其无毒副作用及不存在抗药性等优点，在养殖业中具有广阔的应用前景[4]。枯草芽孢杆菌是饲用微生态制剂的常用菌种之一[5]，其对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很強的抑制作用，能够有效预防水产动物肠炎、烂鳃等疾病;能够分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质;同时具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能够促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分;能够减少对虾病害发生，可以大大提高对虾产量，从而提高经济效益[6-8]。

　　为了便于运输、保存及应用，芽孢杆菌型微生态制剂通常加工为芽孢菌粉。枯草芽孢杆菌HS09具备较好的益生菌性能，常作为微生态菌剂应用于水产养殖业。为了提高产孢发酵水平，本研究进行枯草芽孢杆菌HS09培养基优化，以期降低生产成本，旨在为枯草芽孢杆菌微生态粉剂的工业化生产提供参考依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株

　　枯草芽孢杆菌HS09，由福建汇盛生物科技有限公司研发中心菌种室保藏。

　　1.2 培养基

　　(1)平皿培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH 7.2。

　　(2)种子培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，水1000 mL，pH 7.2。

　　(3)碳源基础发酵培养基：酵母粉8 g，豆粕粉20 g，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.5 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸二氢钾2 g，碳酸钙3 g，水1000 mL。

　　(4)氮源基础发酵培养基：葡萄糖10 g，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.5 g，磷酸氢二钾1 g，磷酸二氢钾2 g，碳酸钙3 g，水1000 mL。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 摇瓶发酵培养 从活化到期的枯草芽孢杆菌HS09平皿挑取2个单菌落接入种子培养基(100 mL/500 mL三角瓶)中，置于37℃，180 r·min-1摇床中培养16 h，按照体积5%的接种量移入发酵培养基(500 mL/2000 mL三角瓶)中，置于37℃，200 r·min-1摇床中培养24 h。

　　1.3.2 碳氮源单因素优化 (1)培养基碳源筛选：在碳源基础发酵培养基中，分别加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1，初始pH 6.8条件下发酵培养，考察不同碳源对枯草芽孢杆菌HS09发酵有效菌数及芽孢产量的影响。(2)培养基氮源筛选：在氮源基础发酵培养基中，分别加入硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1，初始pH 6.8条件下发酵培养，考察不同单一氮源对枯草芽孢杆菌HS09发酵有效菌数及芽孢产量的影响。(3)复合氮源的优化：在单一氮源试验结果的基础上进行复合氮源配比试验，复合氮源配比方案见表1，在初始pH值6.8条件下发酵培养，考察复合氮源对枯草芽孢杆菌HS09发酵有效菌数及芽孢产量的影响。

　　1.3.3 碳氮源正交优化 在碳氮源单因素优化基础上，选择葡萄糖、硫酸铵、玉米粉3个因素，设计L9(34)正交试验优化，L9(34)正交试验设计因素及水平见表2。

　　1.3.4 200 L发酵罐放大培养 从活化到期的枯草芽孢杆菌HS09平皿挑取8个单菌落接入种子培养基(500 mL/2000 mL三角瓶)中，置于37℃，200 r·min-1摇床中培养16 h，按照体积2%的接种量移入体积200 L发酵罐(装液量120 L)中，温度37℃，罐压0.04 Mpa，初始pH值6.8，搅拌转速和通气量控制方案如表3，发酵过程pH自然，培养24 h。每2 h取样检测，观察芽孢形成情况，当芽孢率达到90%即发酵完成，放罐。

　　1.3.5 发酵液菌数的测定 (1)发酵液有效菌落数(cfu·mL-1)测定：采用平板菌落计数法检测细菌总数;(2)发酵液芽孢数量测定：发酵液经80℃水浴加热15 min后，用稀释倒平板法检测芽孢的产量[9]。(3)发酵液芽孢率快速计算：采用血细胞计数板计算发酵液总菌数与芽孢数，芽孢数与总菌数的百分比，即发酵液芽孢率。

　　2 结果与分析

　　2.1 碳源对枯草芽孢杆菌HS09发酵的影响

　　在碳源基础发酵培养基中，分别加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1，考察不同碳源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量的影响。从图1可以看出，枯草芽孢杆菌对4种碳源都可以利用，但发酵后期菌体不易转为芽孢。其中以葡萄糖作为碳源使用时，菌落总数最高，达到2.8×109 cfu·mL-1。因此，选择葡萄糖作为枯草芽孢杆菌发酵的最优碳源。

　　2.2 氮源对枯草芽孢杆菌HS09发酵的影响

　　2.2.1 单一氮源优化 在氮源基础发酵培养基中，分别加入硫酸铵、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1，考察不同氮源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量的影響。从图2可以看出，枯草芽孢杆菌发酵培养基中使用单一氮源，菌落总数整体不高，但不同氮源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量有明显区别。以豆粕粉作为氮源时，菌落总数最高;其中以硫酸铵和玉米粉作为氮源时芽孢转化率最好，分别达到80%和90%。

　　2.2.2 复合氮源优化 根据单一氮源试验结果，在氮源基础发酵培养基上，按照表1所列试验方案，对不同氮源进行复配，考察复合氮源对枯草芽孢杆菌HS09菌落数及芽孢产量的影响。从图3可以看出，使用复合氮源明显提高枯草芽孢杆菌菌落总数，其中以(硫酸铵10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)和(硫酸铵5 g·L-1+豆粕粉5 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)两个组合菌落总数最高，均达到3.5×109 cfu·mL-1，芽孢转化率分别为90%和75%。因此，选择(硫酸铵10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)作为复合氮源，进行下一步正交试验。

　　2.3 正交试验优化

　　2.3.1 碳氮源正交试验优化 根据碳源、单一氮源、复合氮源试验结果，选取葡萄糖浓度为5 、10、15 g·L-1，硫酸铵浓度为2、5、8 g·L-1，玉米粉浓度为10、15、20 g·L-1为试验条件进行正交试验。以芽孢产量为指标，确定最优配比。从表4结果可知，影响枯草芽孢杆菌芽孢产量的主次因素是C>B>A，即玉米粉>硫酸铵>葡萄糖。枯草芽孢杆菌产芽孢培养基中最佳碳、氮源配比为A2B3C2，即葡萄糖10 g·L-1、硫酸铵8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1。

　　推荐阅读：农业经济问题期刊级别

期刊VIP网，您身边的高端学术顾问

文章名称： 枯草芽孢杆菌HS09产芽孢发酵培养基的优化

文章地址： http://www.qikanvip.com/nongyekeji/55482.html