凹线仙女蚬Cytb基因片段序列分析及系统进化树初步构建

　　摘 要：初步探究凹线仙女蚬的系统发育地位，为凹线仙女蚬的分子遗传学研究提供前期数据。采用PCR方法扩增得到凹线仙女蚬Cyrenobatissa subsulcata线粒体细胞色素b(Cytb)基因片段序列，序列长为624 bp，并在NCBI上使用NT数据库进行Blast比对分析，进而构建系统进化树，探讨凹线仙女蚬的分类地位。结果显示NT数据库中未见凹线仙女蚬的Cytb基因信息。研究扩增获得的序列与蚬属其他种的Cytb基因片段有88%的相似性，与其他帘蛤目贝类的相似度77.02%～78.53%，表明扩增出的片段是凹线仙女蚬所特有的Cytb基因片段。基于Kimura′s 2-Parameter模型计算得出，3个样本个体的遗传距离仅为0～0.0016，远小于蚬属内种间遗传距离(0.002～0.114)，与蚬属的遗传距离为0.127～0.144、与帘蛤目帘蛤科种类遗传距离为0.282～0.335。进化树显示，凹线仙女蚬样品独立聚为一支，与蚬属聚为一大支，支持度为99，表明仙女蚬属与蚬属的亲缘关系较近，与帘蛤科的遗传距离较远。

　　关键词：凹线仙女蚬;Cytb基因片段;进化树;遗传距离

　　凹線仙女蚬Cyrenobatissa subsulcata隶属于软体动物门Mollusca、双壳纲Bivalvia、异齿亚纲Heterodonta、帘蛤目Veneroida、蚬科Corbiculidae、仙女蚬属Cyrenobatissa。凹线仙女蚬是中国的地方性物种，分布具有局限性，主要栖息于底质为沙或沙泥的咸淡水交汇处，主要分布于广东省(汕头韩江、吴川鉴江)、广西省(防城)、海南省(排港)和台湾省(淡水、苏澳、安平)[1]。蚬科种类在沿海河口半咸水区域也有较多分布，硬壳蚬属的红树蚬Polymesoda erosa分布于中国、菲律宾等地区，我国主要分布于广东省、广西省、海南省、台湾地区等[2];花蚬属的花蚬Cyrenodonax formosana分布于河口砂质区，产于我国台湾地区(淡水)、福建省(云霄)和广西省(防城)[3];蚬属的河蚬广泛分布于江河、湖泊、沟渠及咸淡水交汇处等水域，在福建省的闽江、乌龙江地区有百年的养殖历史，是河口底栖生物的重要组成部分和重要的经济贝类[4-5]。

　　凹线仙女蚬的研究主要在分类学和生态学[6]，对河蚬Corbicula fluminea等蚬科物种研究较多，包括生态特性、遗传差异分析、生长与繁殖等方面[7-9]。凹线仙女蚬是蚬科中个体最大的物种，具有较高的经济价值[6]。蚬的软体部含有较低的脂肪、较高的蛋白质，蚬肉酶解产物具有解酒护肝的功效，可食用也可作为天然调味品，具有较高的营养价值[10]。由于过度捕捞等一系列对自然环境的不合理利用问题，造成河流生态系统结构破坏、生物多样性骤减和生态系统生产力下降，有些地区的蚬类已处于濒危状态，制约了蚬类产业的发展[11-13]。因此，对凹线仙女蚬种质资源的保护、利用研究已显得十分紧迫。物种的分子鉴定是种质资源研究的重要基础，细胞色素b基因(Cytb)作为一种线粒体DNA分子标记，其结构和功能是线粒体DNA的13个蛋白质编码基因中了解最清楚的基因，已广泛用于魁蚶Scapharca broughtonii、鲢Hypophthalmichthys molitrix、松江鲈Trachidermus fasciatus和河蚬Corbicula fluminea等水生物种的分子鉴定、种间变异程度和亲缘关系、不同地理群体遗传多样性和遗传结构等研究[14-19]，但目前尚未见凹线仙女蚬线粒体基因研究的相关报道。

　　本研究以分布于福州市长乐区凹线仙女蚬群体为研究对象，对其Cytb基因片段进行扩增分析，探讨Cytb基因片段作为凹线仙女蚬种类鉴定的分子标记的可行性，可为凹线仙女蚬的遗传多样性、种质资源研究提供基础资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料

　　1.1.1 凹线仙女蚬样本信息 凹线仙女蚬Cyrenobatissa subsulcata个体全部取自福州市长乐区文武砂镇规划中的滨海新区湿地公园(图1)。

　　1.1.2 试验仪器 PCR仪、凝胶成像分析系统、Nanodrop分光光度计、体视荧光显微镜、电泳仪、解剖镜。

　　1.1.3 试验试剂 蛋白酶K、Quick-DNA Universal Kit 试剂盒(Zymo Research生物科技公司)、琼脂糖(Sigma-Aldrich)、引物(福州擎科生物技术有限公司合成)、 DNA marker(Thermo Scientific)、 PCR mixture(北京全式金生物技术有限公司)。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 形态学性状测定 从采集来的凹线仙女蚬中随机挑选30个，将贝壳表面的水分吸干后，用游標卡尺测量仙女蚬的壳长、壳高、壳宽，精确到0.01 mm。用电子天平测量活体的软体重、壳重、总重精确到0.01 g。凹线仙女蚬的外部形态见图2。

　　1.2.2 凹线仙女蚬基因组DNA的提取 采用Quick-DNA Universal Kit试剂盒提取基因片段，在所选的30个凹线仙女蚬中随机挑选3个个体，分别提取，每个个体取0.1 g的肌肉组织放入EP管，剪碎后加入95 μL无菌水、95 μL Solid Tissue Buffer(blue)和10 μL蛋白酶K。将EP管放入55℃的水浴锅中水浴1.5 h。当组织溶解后，12000 r·min-1离心10 min，取上层液150 μL，移入新的EP管，加300 μL的Genomic Binding Buffer溶液混合均匀。混合液转入Zymo-spin IIC-xl小管中，12000 r·min-1离心1 min，弃掉下管的液体。再加 400 μL的DNA pre-wash Buffer到小管，12000 r·min-1离心1 min。然后加700 μL的g-DNA wash Buffer液体到小管，12000 r·min-1速度下离心1 min，弃掉下管的液体。最后加入37 μL双蒸水。12000 r·min-1离心1 min后得到DNA溶液，之后进行电泳，并用Nanodrop测定DNA完整度和纯度。

　　1.2.3 凹线仙女蚬Cytb基因片段的克隆和序列测定 Cytb基因引物设计参考Yamada等[20]，序列扩增通用引物为CBF6(5′GCAAGCTTTTGATTCTGTTGTTCACATTG3′)和CBR6(5′GTAGGAATCCTACGCAAAATGAGAATAAGCG3′ )。据梯度PCR确定最适温度57℃，在此温度下进行PCR产物的大体系扩增。PCR 100 μL体系如下：模板DNA 2 μL、上下游引物1 μL、2×PCR mixture 50 μL和无菌水46 μL。分别以3只凹线仙女蚬基因组DNA作模板，放入PCR仪扩增。扩增程序为：预变性94℃ 7 min，变性94℃ 1 min，复性57℃ 45 s，72℃延伸2 min，扩增35个循环结束后，72℃再延伸7 min。预期扩增片段大小640 bp，将PCR产物进行1%的凝胶电泳，选择亮度完好、有特异性条带的PCR产物送到尚亚生物公司测序。

　　1.3 数据分析

　　运用Excel对形态学数据进行初步处理，计算变异系数。利用Mega7软件将本研究得到的基因片段在NCBI上使用NT数据库进行Blast比对和序列信息分析。运用Mega7软件内Clustal W进行多序列比对，并辅以人工校对，计算出凹线仙女蚬Cytb基因片段序列长度以及碱基组成;通过Kimura′s 2-Parameter模型计算出凹线仙女蚬与蚬属的其他种Cytb基因片段序列的遗传距离;通过Maximum Likelihood方法对凹线仙女蚬Cytb基因片段进行分子进化树的构建。

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文章名称： 凹线仙女蚬Cytb基因片段序列分析及系统进化树初步构建

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