槐猪与杜洛克猪背部皮下脂肪转录组分析

　　摘要 [目的]了解槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织脂肪沉积的分子机制差异。[方法]对槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织进行转录组测序，并进行生物信息学分析。[结果]槐猪和杜洛克猪分别获得37 858 968和37 545 394条干净读段(clean reads)。槐猪和杜洛克猪分别预测到9 612和9 457可变剪接事件;两猪种间共有709个差异表达基因，与杜洛克猪相比，槐猪有395个上调基因和314个下调基因。差异表达基因共归类到46个GO条目中，其中细胞组分11个、分子功能12个及生物学过程23个;显著富集的KEGG通路共计9个，其中含有与调节脂类代谢显著相关通路，如胰岛素信号通路和PPAR信号通路等。[结论]该研究可为今后研究脂肪沉积的遗传机理提供科学依据。

　　关键词 槐猪;杜洛克猪;背部皮下脂肪组织;差异表达;转录组测序

　　脂肪沉積性状是猪主要的经济性状之一，且与经济价值紧密联系。槐猪(Huai Pig)是福建省特色猪品种，早熟易肥，肉质优良，抗逆性强，但生长速度慢，瘦肉率低，是典型的脂肪型猪种，而西方现代猪种杜洛克猪(Duroc Pig)生长速度快，瘦肉率高，但肉质和抗逆性相对较差，是典型的瘦肉型猪种。为了解槐猪和杜洛克猪皮下脂肪组织脂肪沉积的分子机制差异，笔者对这两个猪种背部皮下脂肪进行了转录组测序，并进行了生物信息学分析。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料与测序

　　选择在相近饲养条件下同期饲养的190日龄槐猪和杜洛克猪各3头，屠宰后分别取倒数第3～4根肋骨之间的背部皮下脂肪组织，置于液氮中贮存;采用TRIzol法提取各样品的总RNA，并采用Nanodrop、Agilent 2100方法对RNA样品的纯度、浓度和完整性进行检测，将符合测序要求的槐猪和杜洛克猪的总RNA分别等量混合，形成2个总RNA池，送交北京百迈客生物科技有限公司进行转录组测序(RNAseq)。

　　1.2 数据整理和分析

　　1.2.1 原始数据去杂。

　　测序所获得的原始序列数据均带有一段3′接头序列，并且含有少量低质量序列以及各种杂质成分，经过数据处理得到可用的干净读段(clean reads)。 具体处理方法如下：去除3′接头序列、去除空载读长、去除低质量读段(含有未知碱基N的读段)、去除长度过小或过大的读段等[1]。

　　1.2.2 序列比对和基因表达量分析。

　　使用TopHat软件将获得的干净读段(clean reads)与猪参考基因组(Sus scrofa 10.2：ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release75/fasta/sus_scrofa/)进行比对，并对比对效率进行统计[2]。采用FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)作为衡量转录本或基因表达水平的指标[3]，FPKM计算公式如下：

　　FPKM=基因区的读段数目×109基因长度×测序深度(1)

　　1.2.3 可变剪切预测。

　　使用Cufflinks软件对基因原有的剪接模型进行比较，进行可变剪接事件(alternative splicing events)预测[3]。常见的可变剪接可分为6种类型：外显子跳跃(exon skipping，ES)、内含子保留(intron retention，IR)、第一个外显子可变剪接(alternative first exon，AFE)、最后一个外显子可变剪接(alternative last exon，ALE)、5′端可变剪接(alternative 5′ splice site，A5SS)、3′端可变剪接(alternative 3′ splice site，A3SS)[4-5]。

　　1.2.4 基因功能注释及差异表达基因筛选。

　　使用BLASTX软件将基因序列与Nr、SwissProt、GO、COG和KEGG数据库进行比对，获得所有基因的注释信息。使用R软件的EBSeq包进行基因差异表达分析[6]，以=|log2(FC)|≥1且FDR<0.01作为筛选差异基因的标准。其中，差异倍数(fold change，FC)表示两样品之间表达量的比值，错误发现率(false discovery rate，FDR)是对差异显著性P值进行BenjaminiHochberg方法校正后得到的[7]。

　　1.2.5 GO功能分类。

　　使用Blast2GO软件对差异表达基因进行GO功能分类，参数e值≤10-5[8]，并使用WEGO软件进行统计并绘图。GO(gene ontology)数据库能对基因、蛋白质进行描述，其包含3个本体：细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物学过程(biological process)。

　　1.2.6 KEGG通路显著性富集分析。

　　以KEGG通路为单位，找出与整个基因组背景相比在差异表达基因中显著性富集的通路，其计算公式如下：

　　P=1-∑m-1i=0

　　Mi

　　N-Mn-i

　　Nn

　　(2)

　　式中，N为所有基因中具有通路注釋的基因数目;n为具有通路注释基因中差异表达基因的数目;M为所有基因中注释为某特定通路的基因数目;m为注释为某特定通路的差异表达基因数目。Q≤0.05的通路定义为在差异表达基因中显著富集的通路(Q表示错误比例，Q=V/R，其中R代表所挑选的差异基因个数，V代表没有差异表达的基因个数，即假阳性结果)[1]。

　　2 结果与分析

　　2.1 测序数据质量评估

　　对槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织进行转录组测序，获得原始读段数目分别为46 891 554和45 309 436条，原始读段经过去杂处理后，获得的干净读段数分别为37 858 968和37 545 394 条，其中78.54%和82.08% 的干净读段(clean reads)比对上猪参考基因组，可以满足后续分析的需要。

　　2.2 可变剪切预测

　　槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织分别预测到9 612和9 457可变剪接事件。由图1可知，在6个常见的可变剪切类型中外显子跳跃的数量最多。

　　2.3 差异表达基因筛选和注释

　　对槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织进行转录组测序，并进行差异表达基因筛选。结果发现，两猪种共有709个差异表达基因，与杜洛克猪相比槐猪有395个上调基因和314个下调基因。各个数据库注释到的差异表达基因数目及所占比例如表1所示。

　　2.4 GO功能分类 由图2可知，槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织的差异表达基因共归类到46个GO条目中，其中细胞组分11个、分子功能12个及生物学过程23个。细胞组分中分类到较多基因的条目为cell part、cell和organelle，分别含540、540和394个基因;分子功能中的条目binding含450个基因;生物学过程中的条目cellular process、metabolic process和biological regulation分别含519、462和412个基因。

　　2.5 KEGG通路显著性富集分析

　　槐猪和杜洛克猪背部皮

　　下脂肪组织之间的差异表达基因共显著富集到9个KEGG通路，通路信息如表2所示。

　　3 讨论

　　该研究对槐猪和杜洛克猪背部皮下脂肪组织进行转录组测序，分别获得了37 858 968和37 545 394条干净读段。陈伟[9]对莱芜猪和大白猪背最长肌的转录组测序分别获得40 498 476 和59 072 892条干净读段。Sodhi等[10]对济州岛本地猪和巴克夏猪的脂肪组织进行了测序，分别获得41 411 459 和40 308 452条干净读段。由此可见，对不同猪品种同一个组织测序所获得的干净读段数目不同;对同一个猪品种的不同组织的测序所获得的干净读段数目也不同，这可能是由于不同组织所行使的生理功能和所含的基因数目不同。

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文章名称： 槐猪与杜洛克猪背部皮下脂肪转录组分析

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