高通量农业基因工程技术VIGS的应用研究

　　摘要：農作物新品种的培育过程中，常常涉及到生物基因工程技术的使用，比如转基因作物新品种、分子设计育种、基因编辑育种等。VIGS技术是农业生产应用中一种反向遗传学的基因工程技术，它一般根据具体育种目标，构建精准的基因沉默病毒载体，最终结合育种实践培育出符合预期的农作物新品种。该文研究了一种高通量的农业基因工程技术VIGS在农作物育种中的基因筛选应用。

　　关键词：VIGS(基因沉默);高通量;农业基因工程;技术应用

　　1 VIGS技术简介

　　由于农作物突变体的收集获得较难，病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技术已经成为一种有效的研究功能基因组学的反向遗传学工具，而且VIGS是农作物基因组功能分析的重要基因工程技术手段。VIGS一般是在已改造、优化的病毒载体中，插入适当大小的目的基因cDNA片段，随着病毒侵染寄主并在农作物组织中大量繁殖后，病毒载体中的目的cDNA片段在农作物体内利用siRNA的生物合成途径产生针对靶标基因的多种siRNA，继而通过siRNA干涉机制，降解靶标基因的mRNA，最终实现对目的基因转录水平的沉默或翻译水平的抑制[1]。农作物VIGS的基本过程包含以下几个方面：1)病毒载体(已插入被沉默目的基因cDNA片段)的构建;2)寄主农作物的病毒侵染(如穿刺法、注射法、高压法和真空渗透法等);3)寄主农作物天然VIGS防御体系针对入侵病毒，产生sRNA并启动sRNA对目的基因的干涉机制[2]。

　　2 VIGS技术在农业基因工程应用中的优势

　　相比较其他可导致目标基因沉默或功能抑制的技术方法，VIGS技术在农业基因工程的实际应用中，具有以下6个方面的优势：1)快速简单、操作方便、实验周期短;(2)不需要繁琐且周期长的遗传转化，当代就能观察农作物目标基因沉默的表型及进一步的分子鉴定;3)只需利用目标基因的一段cDNA片段就能将该目标基因沉默，无需知道基因的完整编码序列;4)对同源性较高的一类基因家族成员，可选择高度保守的区域用以沉默整个家族成员，也可以选择非保守区域用以沉默其中某个家族成员;5)由于有些农作物育种突变体的收集获得较难，而且对于某些沉默致死或不育的基因，也可以利用VIGS的方法来实现对这类基因的功能分析;6)瞬时VIGS技术可用于高通量地筛选分析基因的功能以及可在不同农作物种间完成比较基因学的快速研究[3]。由此可见，VIGS技术具备了上述实验方法和操作上的优势，使其成为一种有效地筛选农作物优质育种基因、研究农作物新基因功能的反向遗传学工具。

　　3 高通量VIGS技术在农作物基因功能检测中的应用

　　本研究以八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因为研究对象，该基因的沉默可导致植物叶片及茎杆组织失绿，即光漂白表型。因此，在实施瞬时基因沉默实验时，往往以PDS基因作为标志性基因或阳性对照。此外，我们利用Web MicroRNA Designer 3(http：//wmd3.weigelword.org，WMD3)平台设计沉默麦类作物PDS基因的amiRNAs_PDS，WMD3网络工具由Weigel创建，以便于设计、选择适当的amiRNA序列，并且提供了AtmiR319和OsmiR528等常用miRNA前体相关的引物，使amiRNA的构建更加快捷。

　　本研究建立了基于BSMV的vamiRNAs表达系统，我们选择了单、双子叶植物不同的miRNA前体为骨架以表达这些vamiRNA_PDS，探索amiRNA的设计和选择标准。另外，以单、双子叶植物不同的miRNA前体为骨架，携带可诱导叶片产生光漂白表型的vamiRNA_PDS，比较分析同源或异源的不同miRNA前体在麦类作物中表达vamiRNAs的情况。实验采用来源不同的5个miRNA前体，他们分别是OsaMIR528，AthMIR319a，TaeMIR171a，HvuMIR168和HvuMIR171前体，其中OsaMIR528和AthMIR319a前体相对于小麦而言是外源miRNA前体，而且AthMIR319a前体相对于小麦来说又是双子叶植物的miRNA前体，其他前体均属于单子叶植物自大麦或小麦内源的miRNA前体。

　　以BSMV表达vamiR_TaPDS为例，利用End-point Stem-loop RT-PCR技术检测不同miRNA前体表达vamiR_TaPDS的相对转录水平，图1-A是该技术原理的示意图。如图1-C所示，半定量RT-PCR利用Stem-loop引物分别扩增vamiRNA 23、26和29循环后，可检测到不同miRNA前体在小麦叶片中均可切割产生vamiRNA。结合Real-time RT PCR(图1-B)，检测不同miRNA前体在小麦中的切割效率，发现OsaMIR528前体可表达出较多的vamiRNA。另外，来源单、双子叶植物不同的miRNA前体均可诱导小麦叶片光漂白表型(图1-D)。

　　因此，BSMV病毒载体携带内源miRNA前体，可以在普通小麦中表达vamiRNA，即“与amiRNA序列相同的sRNA”;并且OsaMIR528前体相对本实验其他miRNA前体，表达vamiRNA的效率更高。可见，利用BSMV病毒载体的VIGS技术，可以高通量沉默目标基因，检测目标基因的功能，这就为农业实际育种过程中，高通量筛选目标基因提供了瞬时、快速和便利技术手段。

　　4 结语

　　与发达国家相比，中国农业育种技术还有差距，需要我们创新育种理念，补上短板，突破传统育种技术的限制，走出多种基因工程育种技术的新路，为保障中国粮食安全提供核心战略支撑。当前基因工程育种技术的重点在于解析复杂性状分子调控网络，阐明其相互效应，构建具有育种价值的分子模块系统，建立模块耦合组装的理论和应用模型，实现高产、稳产、优质、高效多模块的有效组装，创建新一代超级品种培育的系统解决方案和育种新技术。

　　目前，先进的表达小分子RNA的VIGS技术，可以用于农作物新品种目标基因的高通量沉默和筛选，该项技术具有瞬时性、便捷性、快速性和高通量等优点[4]。本研究通过利用BSMV病毒载体，在麦类作物中表达了vamiRNA，建立了基于BSMV病毒载体的sRNA表达系统，为筛选育种目标基因和研究麦类作物靶标基因的功能提供了反向遗传学方法。

　　参考文献：

　　[1]Jiao，J.;Wang，Y.C.;Selvaraj，S.N.;Xing，F.G.;Liu，Y.Barley stripe mosaic virus (BSMV)induced microRNA silencing in common wheat(Triticum aestivum L.).PLoS ONE 2015， 10，e0126621.

　　[2]Tang，Y.;Wang，F.;Zhao，J.;Xie，K.;Hong，Y.;Liu，Y.L.Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants.Plant Physiol.2010，153，632–641.

　　[3]Sha A，Zhao J，Yin K，Tang Y，Wang Y，Wei X，et al.Virus-based microRNA silencing in plants.Plant Physiol.2014;164：36–47.

　　[4]Cai，Q.;Qiao，L.;Wang，M.;He， B.; Lin， F.M.;Palmquist，J.;Huang，S.D.;Jin，H. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science 2018，360，1126–1129.

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文章名称： 高通量农业基因工程技术VIGS的应用研究

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