壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响

　　摘 要：在草鱼饲料中添加不同剂量的壳聚糖，连续投喂42 d，研究壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响。结果显示，与对照组相比，壳聚糖可以提高血清溶菌酶活性、SOD活性、AKP活性、补体C3含量和血液白细胞吞噬活性，并能降低MDA含量。结果表明，饲料中添加5 g/kg的壳聚糖对草鱼的非特异性免疫功能有最好的促进作用。

　　关键词：壳聚糖;草鱼(Ctenopharyngodon idellus);非特异性免疫

　　壳聚糖(chitosan，CS)又称壳多糖，是由天然聚合物甲壳素经过脱乙酰作用而得，通常将脱乙酰度大于70%的称为壳聚糖，其优点很多：良好的生物相容性、可自然降解性、粘膜吸附性、溶菌酶等可使其溶解、本身及其代谢物无任何毒副作用、调节生物体的免疫功能[1-3]。研究表明，壳聚糖对正常生理条件下和处于免疫功能低下的鱼体的非特异性免疫功能均具有提高的功能[4-6]，添加适量的壳聚糖可以提高俄罗斯鲟幼鱼的生长性能和免疫能力[7]。本试验通过在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)基础饲料中分别添加不同剂量的壳聚糖，研究其对草鱼免疫功能的影响，以期为预防草鱼疾病提供新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验鱼

　　试验用草鱼来自辽阳市东荒农场，暂养后从中挑选规格整齐、体质健壮的鱼350尾(平均体质量108 g)，用3%的食盐水溶液消毒后，随机分成5组(每组25尾)，每组2个重复，放入10个(1.0 m×1.0 m×0.5 m)网箱中。设2个对照组。网箱放在7.5 m×7.5 m×1.5 m的水泥池中。

　　1.2 试验设计

　　在基础饲料(表1)中分别添加壳聚糖0 g/kg(C0组)、2.5 g/kg(C1组)、5 g/kg(C2组)、7.5 g/kg(C3组)、10 g/kg(C4组)。饲料原料经粉碎过40目筛后制粒，然后破碎成直径为3 mm的颗粒备用。饲料配制时，所添加的中药免疫增强剂以等量减少麦麸用量保持配方平衡。对照组投喂基础饲料。基础饲料组成及成分分析见表1。

　　1.3 试验过程与饲养管理

　　在正式试验开始之前，将草鱼先暂养两周后转入网箱中。每天在早、中、晚三个时间投喂，投喂量为鱼体重的4%。试验地点在辽宁省淡水水产科学研究院试验基地，试验周期为42 d。试验期间，控制水温在23～28 ℃，DO保持在5 mg/L以上，氨氮小于0.3 mg/L。

　　1.4 非特异性免疫指标的测定

　　1.4.1 样品的采集 在第42天时进行取样，每箱取草鱼3尾，于尾静脉处采血，放入车载冰箱中保存，返回实验室后，于4 ℃下，2 500 r/min离心15 min，收集上层血清，立即测定。

　　1.4.2 血清指标测定

　　溶菌酶活力按王雷等[8]的方法进行测定，溶菌酶活性(U)由下式计算：U=(A0- A)/A0，A0为初始光密度值，A为反应后光密度值。

　　超氧化物歧化酶活性、碱性磷酸酶活性、丙二醛采用南京建成生物技术研究所生产的试剂盒进行测定。补体C3含量采用浙江伊利康生物技术有限公司所生产的试剂盒进行测定。

　　白细胞吞噬活性的测定，于草鱼尾静脉处采血500 μL(采血管和注射器均提前用1%肝素润洗)，加入200 μL嗜水气单胞菌悬液(浓度为1×108 cfu/mL)，涡旋30 s，37 ℃水浴30 min(同时每隔5 min轻轻振荡一次，共振荡4次)，静置10 min。从表面吸取上清进行推片，自然干燥后，经过固定、染色1 min后，用油镜进行观察。以吞噬百分比计算吞噬活性。

　　吞噬百分比=(100个吞噬细胞中参与吞噬的细胞数/100)×100%。

　　1.5 数据分析与处理

　　试验结果以平均值±标准误表示，采用SPSS17.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析和LSD多重比较进行统计分析，显著水平为0.05。

　　2 结果

　　2.1 壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响

　　由表2可知，溶菌酶活性随着壳聚糖添加量的增加而增大，其中壳聚糖添加量为10 g/kg的溶菌酶活性显著高于对照组(P<0.05);添加壳聚糖的超氧化物歧化酶活性均与对照组差异不显著(P>0.05);壳聚糖添加量为5 g/kg的碱性磷酸酶活性最高，且与对照组差异显著(P<0.05)，其余组别的碱性磷酸酶活性均与对照组差异不显著(P>0.05);壳聚糖添加量为5 g/kg和7.5 g/kg的丙二醛含量显著低于对照组(P<0.05)，其余组别的丙二醛含量均与对照组差异不显著(P>0.05);补体C3含量随着壳聚糖添加量的增加而先增加后降低，试验组均高于对照组，其中壳聚糖添加量为5 g/kg时补体C3含量最高。

　　2.2 壳聚糖对草鱼血液白细胞吞噬活性的影响

　　由图1可知，白细胞吞噬活性随着壳聚糖添加量的增加而先增加后降低，添加量为5 g/kg时达到最高，且试验组均显著高于对照组(P<005)。

　　3 讨论

　　溶菌酶在鱼类的非特异性免疫系统中占有重要的地位，也是评价非特异性免疫的重要指标，它对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的杀灭作用，其作用机制是将细胞壁中乙酰基多糖水解并释放出来，从而将侵入体内的异物进行破坏和消除，起到机体防御的作用[9-10]。常青[11]等發现，壳聚糖能够提高花鲈机体的补体活性、增强溶菌酶活性和吞噬活性，并且还有一定的促生长作用。在本实验中，壳聚糖添加量为10 g/kg的溶菌酶活性显著高于对照组(P<0.05);而低添加量组的溶菌酶活性低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。超氧化物歧化酶能够清除机体内多余的自由基，使自由基的生成与清除处于一种动态平衡中，它还与生物的免疫功能有着密切的关系[12-14]。本实验中，试验组的超氧化物歧化酶活性均略低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。这与王秀华[15]的研究结果一致。AKP通过改变致病菌的表面结构，来提高机体识别和吞噬致病菌的能力，进而达到提高鱼体免疫力的作用[9-10]。在本实验中，壳聚糖添加量为5 g/kg的组碱性磷酸酶活性最高，且与对照组差异显著(P<0.05)。MDA的含量可以反映出机体遭受自由基攻击的程度。在本实验中，壳聚糖添加量为5 g/kg和7.5 g/kg时均可显著降低MDA含量，过低和过高添加量对MDA含量没有显著影响。补体在非特异性体液免疫系统中有着特别重要的作用，而C3在补体中又有着重要作用，激活它可以起到杀菌、溶菌作用。在本实验中，当壳聚糖添加量为5 g/kg时，草鱼血清中补体C3的含量达到最高，但继续增加壳聚糖，对补体C3含量反倒起到负作用，这与肖艳翼[7]和汪开毓[16]的研究结果相似。这说明，适量的壳聚糖可以激活草鱼体内补体C3的活性，增强草鱼的非特异性免疫功能，而过量的壳聚糖反而抑制了补体C3的表达。

　　推荐阅读：《中国钓鱼》办刊宗旨是“为广大垂钓爱好者服务，为垂钓事业健康发展服务”。重点介绍垂钓技术和经验，传播国内外垂钓信息，集指导性、实用型、知识性、趣味性为一体。

期刊VIP网，您身边的高端学术顾问

文章名称： 壳聚糖对草鱼非特异性免疫功能的影响

文章地址： http://www.qikanvip.com/nongyekeji/52272.html