一株反硝化细菌在尾水中的脱氮性能研究

　　摘 要：為了提高城市尾水中氮的去除率，优化筛选出一株好氧同步硝化-反硝化细菌，通过调整尾水的氨氮浓度，研究其在不同氨氮浓度的尾水中的反硝化能力。结果表明：好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h的硝化和反硝化能力较强，在24，48 h硝态氮降解率分别达到83.1%和91.1%;在氨氮质量浓度为10 mg/L的城市尾水中，总氮、氨氮、硝态氮去除效果最明显，去除率分别为56.9%，70.2%，91.1%;亚硝态氮出现累积，累积率为20%;氨氮质量浓度为15，25 mg/L条件下，总氮与氨氮去除效果明显降低;在25 mg/L条件下，亚硝态去除率增加，硝态氮去除率不明显。因此，好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h在氨氮质量浓度为10 mg/L的城市尾水中进行异养硝化和好氧反硝化作用的效果最好，其在实验过程中以去除氨态氮为主。所采用的细菌脱氮方法与传统的生物脱氮相比具有节约运行成本、耐氧性好、平衡p值等优势，有着广阔的应用前景。

　　关键词：水污染防治工程;同步硝化;好氧反硝化;城市尾水;氨氮浓度

　　《国际生物制品学》(双月刊)创刊于1973年，由中华医学会上海生物制品研究所主办。本刊为公开发行的国家级学术期刊，主要报道国内外生物制品学领域的新动态、新技术、新进展和新经验。本刊是我国最早出版的、在国内生物制品学界具有重要影响的生物制品学专业期刊。

　　传统的生物脱氮过程分为硝化(N+4→NO-2→NO-3)和厌氧反硝化(NO-3→NO-2→NO→N2O→N2)两个过程，需要分别在好氧和厌氧条件下完成[1-2]。20世纪80年代，ROBERTSON等[3]报道了好氧反硝化细菌和好氧反硝化酶系的存在，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路。目前已经发现的好氧反硝化细菌约50多个属，130多个种，包括了无色杆菌属(Achrombacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、苍白杆菌属(Ochrobacturum)等[4]。其中环境中最普遍存在的好氧反硝化细菌为假单胞菌属(Pseudomonaceae)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)等[5]。与厌氧反硝化细菌的反硝化相比，好氧反硝化细菌(多为异养硝化菌)的硝化过程和反硝化过程可同时进行，硝化的产物可直接作为反硝化的底物，除去了NO-3和NO-2的积累对反硝化的抑制作用，提高了生物脱氮的速度，且这个过程酸碱相对平衡，能使p值保持在一定范围之内[6-7]。

　　中国北方区域降雨量较小，地表水体的生态基流匮乏[8-9]，除了短暂的雨季，水源大部分是来自污水处理厂的尾水。污水处理厂排放的尾水或再生水的水量比较稳定，已逐步成为中国北方区域河流的主要水源之一，但污水处理厂的尾水氨氮浓度限值远远高于地表水V类标准，排入地表水体容易引起水体富营养化[10-11]，甚至导致水体黑臭，许多城市内河出现了常年性或季节性的黑臭现象[12-13]。因此，进行尾水的深度净化及河道的生态修复，增加地表水体的自净能力具有重要的社会效益和环境效益[14-15]。本研究采用筛选的高效好氧同步硝化-反硝化细菌进行尾水脱氮研究，分析了该菌的反硝化与氮代谢特性，以提高脱氮效率，强化尾水的深度净化，缓解地表水质恶化。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验设备

　　超净工作台(苏净集团·苏州安泰空气技术有限公司)、水浴恒温振荡器TZ-82(江苏金坛金城国胜实验仪器厂)、电热鼓风干燥箱101型(北京科伟永兴仪器有限公司)、人工气候箱LR-250-GS(广东省医疗器械厂)、可见分光光度计22PC06119(上海棱光技术有限公司)、手提式壓力蒸汽灭菌器DSX-280B(上海申安医疗器械厂)、紫外可见分光光度计WFZ UV-2802(上海龙尼柯仪器有限公司)。

　　1.2 实验菌株

　　菌株分离水样采自石家庄市桥东污水处理厂A/O工艺的好氧池。

　　1.3 培养基

　　好氧同步硝化-反硝化菌富集培养基(质量浓度g/L)：柠檬酸钠 3.7，(N4)2SO4 2.0，CaCO3 5.0，K2PO4 1.0，FeSO4·72O 0.4，MgSO4·72O 0.5，NaCl 2.0;在富集培养基中再加入2.5%琼脂作为固体分离培养基[16]。鉴别培养基：在上述固体分离培养基中加入1 mL的1%(溶于酒精)溴甲基酚蓝。

　　1.4 分析方法

　　氨氮的测定均采用纳氏试剂分光光度法，亚硝酸盐的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，硝态氮采用紫外分光光度法，总氮的测定采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法[17]。

　　1.5 菌株分离与纯化

　　量取10 mL水样，放入盛有100 mL灭菌的好氧同步硝化-反硝化细菌富集液体摇瓶中，在30 ℃，150 r/min条件下恒温振荡培养72 h，取50 mL上清液转接到100 mL新配制的反硝化细菌富集液体摇瓶中，重复上述实验3次，得到反硝化细菌富集培养液。将得到的富集培养液在鉴别分离培养基上分线，30 ℃培养72 h。在鉴别培养基上选取蓝色单菌落，在固体培养基上划线培养4次，挑取单菌落测定其反硝化能力，选取反硝化效果较好菌株进一步研究。

　　1.6 细菌鉴定

　　细菌16S rDNA通用引物进行鉴定，上游引物27f，下游引物1492r进行PCR扩增，PCR扩增总体系为50 μL，反应条件：预变性94 ℃—5 min，94 ℃—1 min，55 ℃—1 min，72 ℃—1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存[18]。

　　PCR产物送上海美吉生物医药科技有限公司(以下简称美吉生物)进行测序，测序结果通过Clustalx2.0比对，构建系统进化使用软件MEGA 5.05。

　　1.7 实验用水

　　实验用水取自石家庄市桥东污水处理厂尾水排放河道洨河三环桥下，水质状况见表1。为了研究同步硝化-好氧反硝化菌在不同浓度下的脱氮性能，在城市尾水中加入氯化铵调整其氨氮浓度，浓度梯度为10，15，25 mg/L，通过添加葡萄糖控制C/N值为6，温度控制为30 ℃，检测好氧同步硝化-反硝化细菌在氨氮浓度不同的条件下的脱氮性能。

　　2 结果和讨论

　　2.1 菌株同源性分析

　　通过实验反复筛选获得4株好氧同步硝化-反硝化菌株，对所筛选菌株进行测序，Genebank比对，得到系统发育树，如图1所示。

　　对图1分析可知，其中FX1d与FX7h同源性较近，相似度达到99.6%。FX1d属于Proteobacteria，Alphaproteobacteria，Rhizobiale，Rhizobiaceae，Sinorhizobium/Ensifer group;FX7h与Proteobacteria，Alphaproteobacteria，Rhodobacterales， Rhodobacteraceae，Paracoccus，相似度达到99%。ROBERTSON等对异养-好氧反硝化菌研究发现，该类菌的硝酸盐还原酶不需要诱导，其反硝化途径是组成型的，而且证实了无论培养基中有无硝酸盐，都不会影响其硝酸盐还原酶的活性[19]。FX2h与Alphaproteobacteria，Rhodobacterales，Rhodobacteraceae 相似度较高，为99%，表明该菌属于α-变形菌门、红球菌纲、红球菌科，FX0h属于球菌目的节杆菌科。

　　2.2 菌株对硝态氮的代谢能力

　　为了达到更好的反硝化效果，对4株好氧同步硝化-反硝化细菌的氮代谢特征进行研究，结果如图2所示。

　　由图2可以看出，培养基中，菌株FX7h与FX2h对硝态氮的降解率相对较高，2株菌都属于红球菌科，FX7h白色细菌在24，48 h硝态氮降解率达到83.1%和91.1%。FX2h淡红色细菌的硝态氮降解率在24，48 h达到81.4%和88.5%。其余2株菌FX0h与FX1d降解硝态氮的效率较低，因此菌株FX7h为最佳脱氮菌株。本研究选取脱氮效果最好的好氧同步硝化-反硝化菌株FX7h作为研究对象。其形态与革兰氏染色为阳性，菌株呈淡红色、边缘整齐，菌落为圆形，表面光滑，不透明。

　　2.3 在不同氨氮浓度的城市尾水中的脱氮效果

　　研究FX7h在不同氨氮浓度条件下的氮代谢特征，结果如图3—图5所示。

　　如图3所示，总氮浓度逐渐降低，在开始时质量浓度为18 mg/L，60 h后减少为7.8 mg/L，总氮的去除率达到56.9%。氨氮质量浓度也由原来的10.6 mg/L降为4.04 mg/L，氨氮去除率达到70.2%。硝态氮去除效果最为明显，去除率高达91.1%。由图3可以看出，亚硝态氮逐渐升高，质量浓度由开始时的0.14 mg/L积累到0.43 mg/L，亚硝态氮的累积率达到20%。这表明好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h在氨氮质量浓度为10 mg/L时，对总氮、氨氮的去除效果明显，对硝态氮有较好的去除效果，同步硝化效果明显，氨氮去除过程中，部分氨氮转化为亚硝态氮，由于对亚硝态氮的反硝化速率小于亚硝化速率，亚硝态氮出现积累，但对硝态氮的反硝化速率大于硝态氮的合成速率，表明该菌在该浓度下有较好的反硝化效果。

　　由图4 可以看出，同步硝化-反硝化细菌FX7h对总氮和氨氮均有去除效果，60 h后总氮的质量浓度从开始的18.2 mg/L降至10.7 mg/L，氨氮质量浓度由原来的15.9 mg/L降至7.8 mg/L，该菌对总氮和氨氮的去除率分别为40.9%和50.7%，比在氨氮质量浓度为10 mg/L的条件下总氮和氨氮的去除率明显下降，表明氨氮浓度的增减抑制了好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h的活性，降低了该菌对总氮和氨氮的去除效率。硝态氮的质量浓度由开始时的0.81 mg/L降至0.31 mg/L;开始时，在12 h时硝态氮浓度增加，主要由于氨氮浓度的增加，好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h 开始时溶解氧浓度较高，氨氮浓度较高，硝化效果较好，硝化速率大于反硝化速率，随着反应的进行，溶解氧大量被消耗，浓度降低，硝化速率逐渐降低，反硝化速率大于硝化速率，硝态氮浓度降低，IN等[20]的研究也出现了这样的结果。亚硝态氮在氨氮质量浓度为15 mg/L的条件下，浓度逐渐增加，从开始时的014 mg/L，60 h后升至0.44 mg/L，累积率达到207%，比氨氮质量浓度为10 mg/L条件下的累积率变化更为不明显，表明氨氮浓度的增加，对好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h的影响不明显。

　　由图5 可以看出，总氮和氨氮的浓度明显降低，总氮质量浓度从开始时的38.2 mg/L，60 h后降低为26.2 mg/L，降解率为31.5%;氨氮质量浓度由原来的25.4 mg/L降低为13.4 mg/L，降解率为47%，表明好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h在氨氮质量浓度为25 mg/L时，对总氮和氨氮去除均有效果，相比于低浓度氨氮条件下，总氮与氨氮的降解率明显下降，表明氨氮浓度的增加使好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h对总氮和氨氮的去除率降低。图5显示在氨氮质量浓度为25 mg/L时，硝态氮的去除效果不明显，表明好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h在该条件下反硝化效率较低。亚硝态氮质量浓度降低，从开始时的0.75 mg/L，60 h后降低为0.42 mg/L，亚硝态氮的去除效率为44%，表明在氨氮质量浓度为25 mg/L时，由于氨氮浓度增加，促进了亚硝态氮的去除，表明该菌代谢亚硝态氮的能力更强。

　　以上对细菌FX7h代谢特征的分析表明，在氨氮质量浓度为25 mg/L时，总氮、氨氮质量浓度明显降低，亚硝态氮质量浓度也出现降低，硝态氮去除效果变化不明显，各形态氮没有出现积累，这与SUN等[21]报道的好氧反硝化菌株T13脱氨态氮的结果一致。氨氮质量浓度分别为10 mg/L和15 mg/L时，亚硝态氮有明显的积累，氨氮、硝态氮质量浓度减小，该结果与CEN等[22]研究的异养硝化-好氧反硝化菌株CPZ24相似，与LIANG等[23]报道的好氧反硝化细菌Paracoccus denitrificans DL-23脱氮特征一致。以上研究表明，具有异养硝化和好氧反硝化能力的不同菌株脱氨态氮的方式具有不同特征。

　　3 结 语

　　1)确定了从城市污水中优选的1株好氧同步硝化-反硝化菌株FX7h，该菌为红球菌属(Rhodococcus sp.);

　　2)好氧同步硝化-反硝化细菌FX7h在氨氮质量浓度为10 mg/L时，对总氮、氨氮的去除效果明显，对硝态氮有较好的去除效果，同步硝化效果明显，随着氨氮浓度的升高，总氮、氨氮、硝态氮的去除率逐渐降低;

　　3)細菌FX7h对总氮和氨氮有较好的去除效果，在不同浓度氨氮条件下，该菌以去除氨氮为主。

　　4)好氧同步硝化-反硝化细菌的发现，为生物脱氮提供了一种崭新的思路，具有重要的应用前景。该细菌能够在有氧条件下去除受污染水体中的氮素，具有同步硝化-反硝化的能力。在污水处理中，有氧条件下，硝化和反硝化反应可以在一个工段中同时进行，这将大幅度减少土地和资金的需求及管理难度。因此，进一步对好氧同步硝化-反硝化细菌在高盐分、低温等极端环境下的氮素去除进行研究是下一步的研究方向。

　　参考文献/References：

　　[1] TAKENAKA S， ZOU Q， KUNTIYA A， et al. Isolation and characterization of thermotolerant bacterium utilizing ammonium and nitrate ions under aerobic conditions. Biotechnology Letters， 2007， 29(3)： 385-390.

　　[2] KARDENAVIS A A， KAPLEY A， PUROIT . Simultaneous nitrification and denitrification by diverse Diaphorobacter sp.. Applied Microbiology and Biotechnology， 2007， 77(2)： 403-409.

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文章名称： 一株反硝化细菌在尾水中的脱氮性能研究

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