种质资源超低温保存技术及其在草莓中的应用研究进展

　　摘 要：植物种质资源是最重要的自然资源之一，也是植物育种的基础。因此，研究植物种质资源保存技术对维持物种多样性具有重要的现实意义。种质资源超低温保存技术是指植物材料在液氮(-196 ℃)超低温环境中可以长期保存，以保持其遗传稳定性。本文对植物种质资源超低温保存技术的起源、研究现状、保存原理、具体方法、影响因素以及保存时间进行了归纳总结，并概述了其在草莓种质资源保存、脱毒苗培育及草莓再生苗遗传稳定性方面的应用，提出其在发展的过程中冻存机理、材料冻存前后生理状态和普适性技术体系方面的研究有待于进一步深入的观点，并指出其在材料脱毒、抗性育种和遗传转化方面的广阔发展前景，旨在为该技术在植物种质资源保存方面的深入研究和进一步拓展应用提供参考。

　　关键词：种质资源;超低温保存;草莓;研究进展

　　《山西农业科学》(月刊)创刊于1961年，由山西省农业科学院主办。主要刊载生物技术、遗传育种、耕作栽培、生理生化、资源与环境、植物保护、贮藏加工、畜牧兽医等学科的研究报告、学术论文及综合述评等。

　　植物種质资源是指包含各种遗传物质的植物总称，又被称作遗传资源或品种资源，包括栽培种、野生种和人工培育的各种植物的品种或品系[1]。随着科学技术不断进步，工业、农业、制造业需求不断增长，人类掠夺式开采自然资源的方式严重威胁着植物种质资源的保存，目前全球有近十万种植物(超过世界植物种类的1/3)濒临消失的边缘，我国约有15%的植物濒临消失，并且全球气候变暖使这种状况更为恶化[2]。据估计，过去的3个世纪，物种绝迹速度被人为地提高了1 000多倍，大部分城市地区和栽培作物原产地的野生资源及其近缘种都濒临绝迹[3]。

　　植物种质资源保存方法分为3种：传统保存法、离体保存法和超低温保存法。传统保存法分为原生境保存和异生境保存两种[4]，可以较好地保存一些稀有或者即将灭绝的物种以及一些人们需求的特有物种，有助于人们对这些植物种质资源的开发和使用，但需要大量的土地和人力资源，消耗的成本较高，并且容易遭受各种病虫害和自然灾害的侵袭。离体保存法是利用植物细胞的全能性以及组织培养技术获得细胞、组织、器官特定培养材料，通过改变培养材料生长的外部环境条件，使其生长速度降至最低限度，以达到保存种质的目的[5]，离体保存的材料不仅需要按期继代，而且可能会发生染菌和褐化现象导致材料失活[6]，另外随着培养时间的增加保存的材料可能会发生遗传变异[7]。超低温保存法一般是在液氮(-196 ℃)的超低温条件下保存植物细胞、组织或器官，经过超低温保存的植物材料能保持正常的细胞活性、全能性和遗传稳定性，从而达到长时间保存种质资源的目的[8]。

　　本文主要从保存原理、研究现状、具体方法、影响因素、保存时间几个方面对植物种质资源超低温保存技术进行归纳总结，并对其在草莓种质资源保存中的应用进行概括，旨在为该技术在植物种质资源保存方面的深入研究和进一步拓展应用提供参考。

　　1 种质资源超低温保存技术

　　1.1 原理及现状概述

　　植物种质资源超低温保存指的是将植物的器官、细胞等材料置于液氮(-196 ℃)中使其始终处于超低温的环境下进行保存的技术[9]。处于超低温保存的植物材料暂停一切新陈代谢活动，经过解冻和恢复培养该材料再次具有正常细胞的生理活性和遗传稳定性。在这一变化过程中，冻存的细胞内化学成分没有发生本质性改变，仅在物理结构方面发生变化，不会改变细胞内遗传物质以及相关代谢功能，因此在植物材料解冻后仍然能够保持普通细胞的正常生理活性及遗传稳定性，防止因长期继代培育而造成的基因突变和染色体变异等，从而可以实现安全、有效的长期冻存植物材料[10]。

　　超低温保存是目前唯一可以长期保存植物种质资源且不需要继代培育的成本较低的技术，甚至被认为是实现植物种质资源长久、稳定保存的唯一途径[11]。该技术的发展起源于对冷冻保护剂作用的了解，其保存过程中植物细胞需经历剧烈的降温和升温变化，故超低温保存成功的关键是避免降温过程中细胞内冰晶生成以及温度改变对细胞膜系统和代谢酶活性的影响[12]。1949年Polge发现甘油可以减轻超低温对鸟类精子的冻存破坏，1959年二甲基亚砜(DMSO)开始被作为冰冻保护剂[13]。Nag等[14]于1973年首次报道了利用超低温保存技术成功冻存萝卜悬浮细胞的研究。自此以后，经过近四十年的探索和发展，从开始相对落后的快速降温冷冻法、逐渐降温冷冻法[15]，至1981年Fahy首次提出植物细胞玻璃化(即在比较慢的冷却速率下利用高浓度的冷冻保护剂溶液使植物细胞进入玻璃化状态)的概念[16]，提升发展为玻璃化法[17]、包埋玻璃化法[18]、小液滴玻璃化法[15]等，使超低温保存技术日趋完善。截止到2018年，我国已建成1座国家种质资源长期库、1座复份库、10座中期库及种质资源信息系统，保存48.1万余份的种质资源，保存数量位居世界第二，为作物科学和遗传育种提供了雄厚的物质基础[19]。

　　1.2 方 法

　　目前，植物茎尖、芽和分生组织的超低温保存方法主要有如下5种[20]。

　　1.2.1 慢冻法 也称为二步冷冻法，以缓慢的速度连续降温到-196 ℃，或者将材料以0.5～2.5 ℃·min-1的降温速度持续降温到-30～-40 ℃，然后再将茎尖直接浸没液氮中;或者在-30～-40 ℃预冻一段时间，然后再将茎尖浸没于液氮中。

　　1.2.2 快冻法 即在预处理温度下，将材料径直浸没于液氮冻存。

　　1.2.3 包埋脱水法 首先是将材料用海藻酸钙包埋，然后将包埋后的保存材料放在含有高浓度的培养基上进行预培养，之后用通风设备或硅胶对包埋小珠进行干燥脱水处理后投入液氮冻存。

　　1.2.4 玻璃化法 在材料经过预培养后，用高浓度的玻璃化液在常温或0 ℃条件下进行加载处理和脱水处理，然后再将茎尖浸没于液氮中冻存。

　　1.2.5 包埋玻璃化法 先是用海藻酸盐包埋材料，然后用玻璃化液进行诱导脱水，最后将其直接浸没于液氮冻存。

　　1.3 影响因素

　　超低温保存材料能否成功是由材料特性、预培养方法、冷冻保护剂、冷冻方法等因素共同决定的[9]。

　　1.3.1 材料特性 因植物种类不同其基因型不同，同一植物的不同部位或者相同植物相同部位的不同大小其生理活性也不同，导致冷冻成效差别较大，因此植物材料的选择非常重要[21]。例如超低温保存苹果茎尖时，6周龄时成活率只有27% ，而29周龄时成活活率达到86%[22-23];张玉芹等[24]研究发现，体积较小的百合组培球茎尖冻存成活率比较高但之后的恢复培育比较难，而体积较大的百合组培球茎尖成活率较低但之后的恢复培育较为容易。

　　1.3.2 预培养方法 主要目的是减小细胞内自由水含量，有低温锻炼和干燥处理两种方法[9]。低温锻炼可提高细胞液的渗透势和植株内的α-亚氨基酸和聚胺的浓度，增强材料细胞的抗寒性，故预培养可在相当程度上增加植物材料的成活率[25]。陈加利等[26]通过对不同低温锻炼时间对扁桃茎尖存活率的影响进行研究，结果表明，以4周这个时间点为界限，随着低温(4 ℃)锻炼时间的延长，扁桃茎尖经过超低温保存后的成活率呈现先增加后下降的变化趋势，而扁桃茎尖没有经过低温锻炼就进行超低温保存，其成活率为0。干燥处理是使植物细胞的含水量居于一个合适保存水平，防止植物材料细胞内的水分在冷冻过程中生成冰晶对植物造成破坏[27]。

　　1.3.3 冷冻保护剂 可以在一定程度上减少超低温对植物材料造成的伤害，冷冻保护剂可以分为渗透保护剂和非渗透保护剂[28]。渗透保护剂有甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亚砜等化学试剂，分属小分子物质，容易穿过细胞膜和细胞液中的水分子融合，可阻止冻存材料在冷冻和化冻时因过度脱水而死亡[29]。其中二甲基亚砜自身就为毒性物质，用保护剂处理材料时会对其在一定程度上造成伤害，所以在超低温保存时应合理选择冷冻保护剂的种类和用量，及其处理的时间和温度，否则冷冻保护剂就起不到应有的保护作用[30]。非渗透保护剂有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇等，分属大分子物质，不能穿过细胞，但在超低温保存之前，能优先融合溶液中的水分子[29]。

　　1.3.4 冷冻方法 不同的冷冻方法具有不一样的降温速度，而降温速度的快慢又会影响超低温保存后植物材料的成活率，所以不同植物材料的最优降温速度又不一样，器官水平上的植物材料则由植物實现低温锻炼的强度决定冷冻方法，细胞水平上的植物材料主要由细胞膜的通透性能决定冷冻方法[25]。

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文章名称： 种质资源超低温保存技术及其在草莓中的应用研究进展

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