转基因水稻中乳铁蛋白的免疫作用

　　这篇转基因论文发表了转基因水稻中乳铁蛋白的免疫作用，乳贴蛋白具有较好的免疫活性和抗氧化活性，是开发相关保健品的重要资源，植物转基因技术为生产乳铁蛋白提供了新的技术手段。可以将水稻中的乳贴蛋白提取出来，对于免疫力的提高和癌症抵抗方面不可或缺。

　　关键词：转基因论文,转人乳铁蛋白,抗氧化,免疫作用

　　人乳铁蛋白(humanlactoferrin，hLF)是一种分子量约为80ku的多肽蛋白，主要存在于乳汁、眼泪、唾液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。hLF在人初乳中含量较高，达到6～8mg•mL-1[1]。hLF具有广泛的生物学活性，如防止新生儿败血症，促进哺乳动物细胞生长，防辐射，抗菌，抗病毒，宿主防御和免疫调节功能，抗肿瘤等[2-6]，被认为是一种新型的抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。乳铁蛋白的多种生物学功能使其具有广阔的应用前景，以前乳铁蛋白主要从动物乳中提取，但由于天然乳铁蛋白在乳汁中含量低，高昂的成本限制了其大规模的应用。hLF更是由于缺乏原料，不能大量生产。在这种情况下，植物转基因技术为生产乳铁蛋白提供了新的技术手段。

　　1材料与方法

　　1.1材料rhLF

　　由浙江大学转基因研究中心提供，采用农杆菌介导法将hLF基因导入粳稻秀水110号获得，乳铁蛋白的含量占种子干质量的05%，其提取过程按吴景欢等[19]报道的方法进行。RAW2647巨噬细胞株购于中科院上海生命科学研究院;DMEM(高糖)培养基购于Gibco公司、胎牛血清购于上海四季青公司;DPPH(1，1⁃二苯基⁃2⁃苦基肼)、ABTS[2，2⁃联氮⁃二(3⁃乙基⁃苯并噻唑⁃6⁃磺酸)]、PBS，青霉素、链霉素、脂多糖、025%胰蛋白酶⁃EDTA和Griess试剂盒购于Sigma公司。其余试剂均为分析纯试剂。

　　1.2蛋白检测方法

　　分离纯化后的rhLF浓度的测定采用SDS⁃PAGE法。用10%的分离胶和5%的积层胶，对收集到的蛋白样品进行电泳，考马斯亮蓝染色法显色蛋白条带。

　　1.3rhLF清除自由基实验

　　1.31清除DPPH自由基不同浓度的各样品10mL，加入到3mLDP⁃PH(5mmol•L-1)中，摇匀，25℃放置30min，然后在515nm下测定其吸光度，以抗坏血酸为对照，DPPH清除活性可用以下公式来计算样品的清除率：清除率(%)=[(D空白-D样品)/D空白]×100。式中：D样品为样品溶液的吸光值;D空白为空白溶液的吸光值。

　　1.32清除ABTS+自由基ABTS+混合液的制备：将7mmol•L-1ABTS水溶液与245mmol•L-1过硫酸钾水溶液混合，将混合液在室温条件下避光放置12～16h，形成ABTS+自由基储备液。将此工作液用磷酸缓冲液稀释，在734nm下调其吸光度为0700±002，得到ABTS+混合液，于30℃下预热备用。取05mL溶液加入1mLABTS+混合液混合均匀，室温下避光静置30min后于波长734nm下测定吸光值，以去离子水作为空白对照。ABTS+清除率(%)=(1-D样品/07)×100。式中D样品为样品溶液的吸光值。

　　1.33清除羟基自由基活性1mL样品液中加入6mmol•L-1FeSO4溶液1mL，混匀后加入6mmol•L-1H2O2溶液1mL，混匀后静置10min，加入6mmol•L-1水杨酸1mL，混匀后37℃水浴反应30min，3000r•min-1离心10min，取上清液于510nm处测定吸光值，以蒸馏水作为空白对照组，计算清除率。清除率(%)=[(D空白-D样品)/D空白]×100。式中：D样品为样品溶液的吸光值;D空白为空白溶液的吸光值。

　　1.4rhLF对RAW2647细胞的作用研究

　　1.41小鼠巨噬细胞系RAW2647细胞培养采用DEME培养基(100U•mL-1青霉素和100μg•mL-1链霉素、10%FBS)，于37℃，5%CO2条件下培养，细胞生长至90%时，用025%胰蛋白酶⁃EDTA消化细胞，传代，取对数生长细胞进行实验。

　　1.42RAW2647细胞增殖的检测调整细胞密度为1×104mL-1，接种于96孔板，体积为100μL，于37℃、5%CO2下培养24h，加入100μL不同浓度的rhLF，使最终浓度为00625，01250，02500，05000，10000和20000mg•mL-1，设空白对照组。以100μg•mL-15⁃FU为阳性对照，培养48h后加入CCK⁃8，轻轻振荡，继续培养2～4h。酶标仪于490nm处检测吸光值，每个平行浓度设3个重复。

　　1.43RAW2647细胞吞噬活性的检测调整细胞密度为3×105mL-1，接种于96孔板，体积为100μL，于37℃，5%CO2下培养24h后，加入100μL不同浓度的测试样品，使最终浓度为025～300mg•mL-1，设空白对照组。培养48h后弃去上清，每孔加入100μL0072%中性红试剂，于37℃，5%CO2下培养箱孵育30min，弃去中性红，用PBS清洗3次，每次100μL，并甩干。每孔加入醋酸⁃乙醇(体积比1∶1)细胞裂解液100μL，4℃过夜，用酶标仪于570nm检测吸光值，每个平行浓度设3个重复。

　　2结果与讨论

　　2.1纯化后的rhLFSDS⁃PAGE纯度检测

　　从转基因水稻中经硫酸铵分级沉淀、弱阳离子交换层析、分子筛层析及膜包脱盐浓缩后，获得较高纯度的rhLF(图1)。

　　2.2rhLF的抗氧化实验

　　2.21rhLF的DPPH清除活性DPPH是一种非常稳定的自由基，在517nm处有强吸收，当遇到自由基清除剂时，其分子上的单电子被配对而使颜色变浅，可以用此来评价试样的抗氧化能力[20]。从图2可知，随着浓度的增加，rhLF对DP⁃PH自由基的清除率逐渐升高，其浓度与清除度有良好的量效关系。在0125～4000mg•mL-1浓度下，rhLF的DPPH清除率在1832%～7890%。与阳性对照抗坏血酸相比，rhLF的清除率偏低。抗坏血酸在测试浓度范围内一直显示了很强的抗氧化活性，即使在最低浓度下(0125mg•mL-1)，DPPH清除率也达到了8436%。2.22rhLF的清除ABTS自由基活性由图3可知，rhLF对ABTS清除率随着浓度的增加逐渐增大，总体上变化不剧烈，浓度与清除率存在很好的线性关系。在浓度为4mg•mL-1时，rhLF对ABTS的清除率达到了865%。阳性对照组抗坏血酸显示了很强的抗氧化活性。在所测试的浓度范围内，抗坏血酸的ABTS清除率都非常高，最低也接近于90%。

　　2.23rhLF清除羟基自由活性在所有的氧自由基中，羟基自由最强，危害也最大，所以对清除羟基自由基的研究非常重要。H2O2争夺金属离子进而抑制羟基自由基的产生。如图4所示，rhLF对羟基自由基的清除率随浓度的增加逐渐增大，总体上变化不剧烈。抗坏血酸对羟基自由基的清除率随浓度增大，先缓慢升高，当达到某一阈值后急速升高，表现出很强的对羟基自由基的清除效果。相对于阳性对照抗坏血酸，rhLF的抗羟基自由基的活性很低，在测试浓度范围内，4mg•mL-1的浓度下，羟基自由基的清除率也仅为411%。而抗坏血酸在最低浓度(0125mg•mL-1)时，清除率就已达到了694%。本实验通过研究rhLF对DPPH、ABTS及羟基自由基的清除效果来检验其抗氧化能力。结果显示，rhLF对DPPH、ABTS和羟基自由基具有一定的清除能力，并呈现剂量依赖型。

　　2.3rhLF的免疫调节作用

　　2.31rhLF对RAW2647细胞增殖的影响由图5可知，随着rhLF浓度的增加，RAW2647细胞增殖率有所增高，当浓度达到0.5图4水稻转人乳铁蛋白的清除羟基自由基活性Fig.4Scavengingeffectsofrecombinanthumanlacto⁃ferrinonhydroxylradicalmg•mL-1时，增加极显著。当浓度达到1mg•mL-1时，rhLF促进细胞增殖率最高(6241%)。随着浓度的增加，对细胞的增殖有所下降。这说明，当rhLF在低浓度时，显著地促进RAW2647细胞的增殖，但是当浓度增加到一定值时，会对细胞的生长产生抑制作用。综上所述，rhLF在00625～10000mg•mL-1浓度范围内对RAW2647细胞具有良好的增殖作用，能提高巨噬细胞的密度和活力，对于提高机体免疫力具有很大的作用。

　　2.32rhLF对RAW2647吞噬活性的影响由图6可知，当浓度小于1mg•mL-1，RAW2647吞噬活性呈较快的升高，随着浓度的升高，吞噬活性变化不大。整体上剂量关系依赖不强烈。在浓度为2mg•mL-1时，吞噬活性最高达到了6989%。综上所述，rhLF在测试浓度范围内对RAW2647细胞吞噬活性有明显的提高作用，它能增强RAW2647细胞对抗原的吞噬，进而加快巨噬细胞将抗原递呈给其他免疫细胞，加速引发免疫反应。本实验研究了rhLF对RAW2647细胞增殖及吞噬能力的影响，发现其能够促进细胞增殖分裂，刺激免疫细胞增殖分裂，在对应外来抗原和自身癌变中具有重要的意义。rhLF提高了RAW2647的吞噬活性，进而提高了其捕捉抗原的能力，这对于提高机体免疫应答有重要意义。rhLF对免疫细胞因子分泌的促进，对于免疫力的提高和癌症抵抗方面不可或缺[21]。

　　作者：秦毅 吕国英 张作法 单位：浙江大学技术转移中心 浙江省农业科学院园艺研究所

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文章名称： 转基因水稻中乳铁蛋白的免疫作用

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