海南岛柑橘肾形线虫病的发生及病原鉴定

　　摘要 据调查发现海南岛柑橘根部寄生线虫危害严重，其根部主要寄生线虫为肾形线虫(Rordlenchulus spp.)，且分布广泛，侵染根部对其造成严重影响。从海南岛柑橘园中采集表现为黄化、小叶等症状的发病植株根部土样，用改良贝曼漏斗法分离土壤线虫，通过形态学观察与测量、28S rDNA D2-D3区序列扩增、测序、比对及进行系统发育分析。结果表明，在60份土样中该线虫检出率为66.7%，虫口密度最高达513条/100 mL土：由形态学鉴定为肾形线虫。对肾形线虫28S rDNA D2-D3区PCR扩增条带大小为780 bp左右，与目标基因大小一致。测序结果与GenBank中登录的数据进行Blast比对，与肾状肾形线虫(Rorylenchulus renijormis)数据同源性高达99%以上。根据比对结果构建系统发育树，结果与已报道的肾状肾形线虫聚为一类。结合形态学与分子生物学技术，将该线虫鉴定为肾状肾形线虫。本研究对柑橘根部土壤肾形线虫的调查和鉴定研究，为该病害的诊断和防治提供理论参考。

　　关键词 柑橘，肾状肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)，鉴定

　　Abstract According to the survey, the parasitic nematodes in the citrus roots of Hainan Island were seriously endangered. The main parasitic nematodes in the roots were Rotylenchulus spp. which were widely distributed inHainan Island. The nematodes parasite plants roots and made a severe influence on them. Root soil samples were collected from the diseased plants showing yellowing and lobular of the citrus orchards in Hainan island, and the soil nematodes were isolated by modified Beman funnel method. Morphological observation and measurement, 28SrDNA D2-D3 region amplification and sequencing were performed, then alignment and phylogenetic analysis were conducted. The results showed that the detection rate of the nematode was 66.7% in 60 soil samples, andthe highest population density was 513/100 mL soil; it was identified by morphology as Rotylenchulus spp. The size of the PCR amplification band of the 28S rDNA D2-D3 region of the Rotrlenchulus spp. was about 780 bp, which was consistent with the target gene size. The sequencing results were compared with the data registered in GenBank for Blast, and the homology with the Rotylenchulus reniformis was over 99%. The phylogenetic tree was constructed based on the alignment results, and the results were clustered with the reported nephrons. The nematode was identified as Rotrlenchulus reniformis in combination with morphology and molecular biology techniques. This paper investigated and identified Rotilenchulus spp. in the citrus roots, providing a theoretical reference for the diagnosis and prevention of the disease

　　Keywords Citrus. Rotylenchulus reniformis, Identification

　　柑橘(Citrus reticulata Blanco.)是世界第一大水果，目前中国有19个省(市，区)大规模种植，是世界最大的生产国。海南岛种植的柑橘类果树中以琼中“绿橙”和澄迈“福橙”最为知名，已成为当地农民脱贫致富的主导产业之一，对农业增效和农民增收起着至关重要的作用。其中，琼中“绿橙”和澄迈“福橙”前身均为广东红江橙(Citrus tangerine Hot.et TanakaxCitrus sinensis(L.)Osbeck)，绿橙于20世纪80年代初引入琼中县，而福橙也已于2002年引入澄迈县。柑橘线虫病是造成产量损失和品质下降的主要病原之一(向旭等，2009)。近年来，随着种植面积扩大和栽培年限增加，出现了可能因寄生线虫为害而诱发的植株衰退现象。有研究表明，肾形线虫属(Rotylenchulus spp.)广泛分布于地中海、热带与亚热带地区，已有11个物种被报道(Palomares-Rius et al，2018)。在中国，肾形线虫病在香蕉园发病普遍，且对香蕉危害严重

　　(周峡等，2012)。在美国东南部，肾形线虫造成棉花减产通常为1%~5%，2015年估计损失24.211x10kg，价值约为3600万美元(Ruijuan et al，2018)肾形线虫以雌虫侵染植物根系，在取食过程导致根部膨胀类似于肾脏(Wubben et al.，2015);被害植株常表现根系皮层组织脱落，甚至坏死或腐烂，地上部表现为植株矮小、叶片黄化，产量降低，严重者整株死亡(Robinson et al.，1997)，28s DNA D2-D3区是不同植物寄生线虫基因组保守的区域，在其种类鉴定中有很多应用(王会芳等，2015)，本研究对海南岛柑橘主要产区肾形线虫病发生危害情况进行调查，并利用形态学和28S r DNA D2-D3序列分析进行病原鉴定，以期为该病害的准确诊断和高效防治提供依据。

　　1结果与分析

　　1.1发生与为害

　　在被调查的海南岛2个县12个柑橘园中，发现其中8个被肾形线虫侵染为害，果园受害率为66.67%。绿橙园中的线虫种群密度比福橙园中的大(表1)，砂质土果园中线虫种群密度比黏质土果园中的大，表明砂质土有利于肾形线虫的发生和侵染。8个柑橘园中，线虫种群密度最大为513条100 mL土

　　(琼中县弯岭排营坡村)，最小为28条100mL土(澄迈县红光农场团结队)。

　　1.2形态特征

　　未成熟雌虫(RRLC1种群)：加热杀死后虫体呈"C"形，唇区隆起、前端圆，呈梨形，无缢缩，唇架骨硬化(图la)：口针长12.6-16.9um，基部球圆形，高3.4-4.1 um，2.5-3.2 pm，食道腺长，口针基部球距食道腺开口距离与口针长度约相等;中食道球及瓣门清楚，中食道球长近圆形;排泄孔位于食道峡基部(图1b)，最大体宽14，7-17.4 um。阴门横裂，双生殖腺对生(图10)：尾部长25.3-34.1 um，呈长圆锥形，透明尾端长4.2-9.4 um(图1d)。

　　雄虫(RRLC1种群)：食道、口针和食道腺模糊，中食道球不明显，无明显瓣膜(图1e;图1h);交合刺伸出体外长16.7-21.1 pum，交合伞退化(图1g)，未完全包盖尾端(图1c)。

　　根据形态特征观察和测量值(表2)，初步将其鉴定为肾状肾形线虫(Rotylenchulus renjormi)，与张燕等(2011)报道的一致。

　　1.3分子生物学鉴定及同源性分析

　　对8个线虫种群28S rDNA D2-D3区进行扩增，由PCR扩增电泳图，结果显示，其片段长度均在780 bp左右(图2)，RRLC1和RRFC8种群克隆后的测序结果为786 bp，与肾状肾形线虫序列长度一致。

　　从8个肾形线虫种群中选出2个种群进行测序。将288 rDNA D2-D3区测序结果与Gen Bank中登录的数据进行Blast比对。结果表明，在同源性已明确的100个种群中，RRLC1和RRFC8种群与海南香蕉种群HM131858.1、浙江种群KPO 54126.1和广东木瓜种群HM131883.1相一致，其与肾状肾形线虫的同源性最高，均达到99.62%以上。

　　将测序的2个肾状肾形线虫种群与Gen Bank中公布的肾形线虫属中其它种群种类和相近的属同时进行分析，基于28S rDNA D2-D3区序列，利用MEGA 7.0软件采用邻接法构建基于28S rDNAD2-D3区序列的柑橘肾形线虫RRLC1和RRFC8种群的系统进化树(图3)，结果表明，RRLCI和RRFC8种群与NCBI中登陆的肾状肾形线虫聚为一类。且其与国内外已报道的肾状肾形线虫的亲缘关系较近：与Rotylenchus conicaudatus Rotylenchus brevicaudatus和Rotylenchulus macrosoma等的亲缘关系较远。RRLC1和RRFC8种群与孢囊线虫属(Heterodera spp.)、螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.)、仙人掌皮线虫属(Cactodera spp.)、球孢囊属(Globodera spp.)等的亲缘关系较远。

　　结合以上形态学观察、形态测量值和分子生物学鉴定及同源性分析结果，将来自于海南澄迈和琼

　　中的柑橘肾形线虫RRLC1和RRFC8种群最终鉴定为肾状肾形线虫(Rotylenchulus reniformi)

　　2讨论

　　本研究对采集于海南岛柑橘类果树8个种植区柑橘园的肾状肾形线虫的未成熟雄虫和雄虫形态特征进行了观察，发现不同肾状肾形线虫种群间的形态测量值存在差异。本研究测量值比张燕等(2011)报道的福建种群偏大，而在张绍升和章淑玲(2005)报道的福建种群的体长范围之内。通过对其中2个种群(RRLC1和RRFC8)的28 rDNA D2-D3序列与和Gen Bank数据库中序列比对分析，发现其与登录号HM-131858.1，KP054126.1和HM131883.1的相似度达99%以上。国内外已报道R.reniformi种群的同源性存在极小地域差异。

　　肾状肾形线虫作为重要的植物病原，可导致植物发育迟缓，抑制根系生长和降低产量。但是田间症状表现不明显，难以在视觉上评估线虫造成的损害(Rujuan et al.，2018)。据报道(Robinson，2007)，美国中南部地区棉花上肾状肾形线虫已经取代了根结线虫(Meloidogyne spp.)而成为主要病原线虫。相对于根结线虫和孢囊线虫，肾形线虫研究较少。高小倩(2012)对福建柑橘线虫病病原进行了鉴定，发现肾状肾形线虫是影响柑橘生长的重要线虫种类之一。肾状肾形线虫侵染为害后地上部的症状与植株缺水缺 素相似，因此被不易察觉，对海南岛柑橘产业的发展 存在潜在威胁，应引起足够重视。

　　3 材料与方法

　　3.1 样本采集和分离 采用 5 点取样法，于 2018 年 5~10 月分别从海南 岛 12 个柑橘园中采集柑橘根系及根际周围 5~20 cm深的土壤，将样品装入封口袋并做好标记，实验室内 用改良贝曼漏斗法分离土壤中的线虫。

　　3.2 形态学鉴定

　　挑取未成熟雌虫和雄虫各20 条线虫制作临时玻 片，在光学显微镜下进行形态学观察和显微计测。对线虫的体长(Body length)、最大体宽(Maxmun body width)、口针长(Stylet length)、口针基部球高(Stylet knob height)、口针基部球宽(Stylet knob width)、背食道腺开口至口针基部球距离(DGO)、尾长(Tail)、交合 刺长(Spicule length)等主要形态学特征进行测量。

　　3.3 分子鉴定

　　采用林伯荣等(2017, 中国农业科学技术出版社,pp.1-3)方法提取单条线虫的DNA。使用通用引物 D2：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3';引物 D3：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'，引物由上海 生工合成。扩增程序条件：初始变性温度为 94℃，时 间 3 min，变性温度为 94℃，时间 60 s，退火温度为55℃，时间 90 s，延伸温度为 72℃，时间 1 min，共 34个 循环，再 72℃延伸 5 min。将扩增产物克隆到 T 载体(PMD-18Tvector, TaKaRa, 日本)，转化 DH5α 菌株; 挑取阳性克隆子送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序结果整理拼接后，登录 GenBank 获得相应登录号。通过 DNAMAN 7.0 软件对 28SrDNA D2-D3 区序列进行相似性分析。用 MEGA7.0软件将所得序列通过邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树。

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