小柴胡汤对体外培养LX-2细胞增殖的影响及机制初探

　　【摘要】目的 观察小柴胡汤对人肝星状细胞(LX-2细胞)增殖的影响。方法 体外培养LX-2细胞，用不同浓度的小柴胡汤(2%.1%，0.5%，0.2%，0.1%)处理24 h，对照组不做处理。显微镜下观察药物作用后细胞形态改变，采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和5-乙炔基-2脱氧尿嘧啶核苷(Edu)法检测细胞增殖，实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测1型胶原(COL-I)mRNA的表达情况。结果 对照组细胞，贴壁生长良好，形态未见明显异常。经不同浓度小柴胡汤(2%、1%、0.5%，0.2%，0.1%)处理24 h后，LX-2细胞均出现皱缩，变圆，界限不清，细胞核固缩等不同程度形态改变，MTT检测显示其增殖抑制率分别为100%，54.9%、41.2%、14.8%、12.4%。经1%、0.5%、0.1%小柴胡汤作用24 h后，Edu法检测LX-2细胞增殖率分别为0.1%，5.3%，10.1%;RT-PCR检测其COL-I mRNA的表达量，与对照组1.04±0.35相比，均显著下降，分别为0.45±0.15(P<0.05)、0.27±0.16(P<0.01)和0.38±0.24(P<0.01)，MTT和Edu结果表明小柴胡汤能够抑制体外培养L.X-2细胞的增殖，并呈剂量依赖效应。结论 小柴胡汤通过抑制LX-2细胞增殖，并抑制COL-I mRNA的表达，从而发挥抗纤维化活性。

　　【关键词】小柴胡汤;血吸虫病;肝纤维化;LX-2细胞;细胞增殖

　　[ Abstract Obiectives To observe the effects of a Xiaochaihu decoction (XCH) on the proliferation of human hepaticstellate cells (LX-2). Methods LX-2 cells were cultured and treated with different concentrations of XCH (2%, 1%,0.5%, 0.2%, and 0.1 %) in vitro for 24 h. The control group was not treated. Changes in cell morphology were observed under a microscope. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and 5-ethynyl-2deoxyuridine (Edu) were used to evaluate LX-2cell proliferation. RT-PCR was used to evaluate expression of type I collagen (COL-I) mRNA in cultured cells. ResultsIn the control group, the cells grew well and had no obvious abnormalities. After treatment with different concentrations of XCH (2%. 1%. 0.5%. 0.2%, and 0.1 %) , LX-2 cells displayed various morphological changes, such as shrinkage, roundness, indistinct boundaries, and nuclear pyknosis. An MTT assay indicated that the rate of inhibited prolifera tion was 100 %, 54.9%, 41.2%, 14.8%, and 12.4%, respectively. After treatment with 1%, 0.5%, or 0.1% XCH for 24 h, the rate of LX-2 cell proliferation was respectively 0.1 %, 5.3% , and 10.1% according to Edu. The level of expres sion of COL-I mRNA in LX-2 cells was 0.45±0.15 (P<0.05), 0.27±0.16 (P<0.01), and 0.38±0.24 (P<0.01), reflecting a significant decrease compared to 1.04±0.35 in the control group. MTT and Edu results indicated that XCH inhibited the proliferation of LX-2 cells in a dose-dependent manner. Conclusion XCH plays an antrfibrotic role by inhibiting the proliferation of LX-2 cells and the expression of COL-I mRNA in LX-2 cells.

　　[ Key words Xiaochaihu decoction; LX-2 cells; cell proliferation; schistosomiasis; liver fibrosis

　　血吸虫虫卵定植于肝脏，造成肝损伤进而导致一系列的肝脏病变，如肝脏炎症、纤维化、肝腹水等[1，是血吸虫病的主要临床症状，其发生机制尚不十分明确，且尚无特效药物，迫切需要筛选或研发新的抗纤维化药物。中药因具有多靶点、多途径的作用特点，在临床上应用广泛[-3。小柴胡汤出自汉代张仲景的《伤寒论》，由柴胡、黄芩、人参、半夏、生姜、炙甘草、大枣七味中药材组成，具有疏肝利胆的功效，常用于肝胆疾病的治疗[。在病毒性肝炎、酒精性肝炎等引起的肝纤维化的治疗中具有显著疗效[-句，且小柴胡汤可缓解血吸虫感染引起的小鼠肠道损伤[，但是其对血吸虫所致肝纤维化的作用尚不明确。有研究表明，肝星状细胞的活化和增殖，细胞外基质(ECM)的沉积是肝纤维化形成的关键因素[。血吸虫感染机体后，虫卵沉积于肝脏引起肉芽肿，进而形成纤维化等一系列复杂的病理变化。动物实验发现，小柴胡汤可延缓血吸虫慢性感染引起的小鼠肝纤维化进程[1，推测小柴胡汤可能通过抑制肝星状细胞增殖并减少细胞外基质的沉积，从而发挥其抗纤维化功效。

　　本研究旨在观察小柴胡汤对人肝星状细胞(LX-

　　2)体外增殖的影响，并分析其干预细胞活化和增殖的作用机制，为小柴胡汤用于治疗血吸虫病肝纤维化的临床应用提供理论依据。

　　材料与方法

　　1材料

　　1.1 细胞 人肝星状细胞株LX-2细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

　　1.2 试剂与仪器 DMEM高糖培养基(美国Hy clone公司，Cat：SH3002201);胎牛血清(美国Gibico公司，Cat：10270-106);胰酶(中国碧云天公司，Cat：C2020);Edur594细胞增殖检测试剂盒(中国碧云天公司，Cat：C0078s);MTT试剂(中国碧云天公司，Cat：ST316);逆转录试剂盒(中国Vazyme公司，CAT：R323-01);qPCR Master Mix(中国Vazyme公司，CAT：Q711-02/03);细胞培养板(美国Corning公司，Cat：3516，3525，3599);细胞培养瓶(美国Corning公司，Cat：430614，430639);CO2培养箱(美国Themo Fisher公司);超净工作台(中国冯氏实验动物设备有限公司，CJ-2F型);多功能检测平台(美国BD公司，SpectraMax i3);流式细胞仪(美国BD公司，BD Verse);荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司，Light Cy cler480);倒置荧光显微镜(德国Laica公司，DM14000)，高压灭菌器(日本Tomy公司，SX-500);紫外分光光度计(美国Themo Fisher公司，Nanodrop 2000);分析天平(瑞士梅特勒公司，ME104)。

　　2方法

　　2.1 小柴胡汤制备 由南京中医药大学附属无锡中医医院中药房热制。处方：参照《中国药典》：柴胡48

　　g、黄芩18g、人参18g、半夏18g、炙甘草18g、生姜18 g、大枣80 g，共218g，熬至90ml。每1ml含有

　　2.42g中药，将熬制的小柴胡汤离心去沉渣，经0.22

　　um滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用，使用前37℃温浴并稀释到所需浓度。

　　2.2 细胞培养 取LX-2细胞复苏后，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM培养基培养于37 ℃.5%cO2的培养箱中，细胞密度达80%时进行传代。

　　2.3 MTT法检测细胞增殖 收集处于对数生长期的L.X-2细胞，调整细胞浓度至1×10/ml，接种于96孔板，每孔1×10'个细胞。观察细胞贴壁并恢复到正常状态后，血清饥饿4h，实验组分别用2%、1%.

　　0.5%、0.2%、0.1%小柴胡汤处理;对照组不做处理，每个组均做6个复孔，分别于2、4，8，24 h观察细胞形态。小柴胡汤加入培养基作用20 h后加入MTT试剂继续培养4h，吸弃上清，每孔加入150 pl DMSO

　　(二甲基亚码)，测吸光度Aso值，计算细胞生长抑制率

　　(%)。细胞生长抑制率=[1-(实验组平均A值÷对照组平均A值)]×100%

　　2.4 Edu法检测细胞增殖 收集处于对数生长期的LX-2细胞，调整细胞浓度至1× 10/ml，接种于6孔板，每孔2×10"个细胞，贴壁后血清饥饿4 h，药物刺激24 h后，每孔加入1 ml 37 ℃预热的2XEdu工作液继续孵育细胞2 h，按照试剂说明书方法固定、通透、洗涤、染色进行荧光检测。

　　2.5 RT-PCR 细胞经小柴胡汤作用24h后提取总RNA，溶解于20 gl 0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水中，紫外分光光度计测RNA浓度及纯度，按照试剂说明书进行逆转录反应获取CDNA，并进行RT-PCR反应，用磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参，通过2-法计算基因相对表达水平。COL-1引物F：5-

　　AGGGTCACCGTGGCTTCT-3;R：5-TCTGCTG-GCTCAGGCTCTT-3.GAPDH引物F：5 CG-GATTTGGTCGTATTGGG-3：R：5'-TGGAAGAT-GGTGATGGGATT-3，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　2.6 统计学分析 实验数据用均值士标准差(x±s)

　　表示，绘制软件采用Graphpad Prism 6，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　1小柴胡汤对LX-2细胞形态的影响

　　小柴胡汤处理LX-2细胞24 h后，细胞形态出现不同程度改变(图1)。空白对照组细胞贴壁生长良好，形态无明显改变。与对照组相比，经2%小柴胡汤处理的细胞，大部分皱缩、变圆、界限不清、细胞核固缩;经1%、0.5%小柴胡汤处理的细胞也有不同程度的皱缩、变圆;经0.2%、0.1%小柴胡汤处理后，有一小部分细胞产生皱缩、变圆等形态学变化。

　　2 MTT检测细胞增殖结果

　　利用2%、1%、0.5%，0.2%、0.1%小柴胡汤作用LX-2细胞24 h，MTT检测细胞增殖抑制率，分别为100%，54.9%.41.2%.14.8%，12.4%(表1)。表明小柴胡汤对L.X-2细胞增殖起抑制作用，呈剂量依赖。

　　3 Edu检测细胞增殖结果

　　1%、0.5%、0.1%小柴胡汤作用LX-2细胞24 h Edu法检测其增殖率，分别为0.1%，5.3%，10.1%，与对照组细胞增殖率32%相比，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2，图3)

　　4实时荧光定量PCR结果

　　LX-2细胞经1%，0.5%，0.1%小柴胡汤处理24 h后，RT-PCR检测其COL-I mRNA的表达量分别为0.45+0.15(P<0.05)，0.27 +0.16(P<0.01)和0.380.24(P<0.01)，与对照组1.04±0.35相比，表达水平均显著下降(表2).

　　讨论

　　我国血吸虫病防治已从传播控制转入传播阻断及消除阶段，但仍存在大量晚期血吸虫病患者，加之低度流行态势下血吸虫感染后虫卵致肝病变过程较长，且机制复杂[0-13，给预防和治疗带来困难。因此，发展有效的抗纤维化药物对于血吸虫病治疗意义重大。

　　肝星状细胞(HSCs)的激活和增殖，以及细胞外基质(ECM)的过度沉积是肝纤维化形成的关键环节,多种细胞、细胞因子以及信号转导途径参与其中[-3]。有研究发现青蒿琥酯可通过调节1X-2细胞的增殖、凋亡和活化发挥抗纤维化作用[13)，。柴胡皂苷a通过线粒体依赖途径诱导肝星状细胞凋亡[2]，抑制纤维化进程。黄芩提取物可通过TGF-P1/SMAD信号通路降低HSCs 中a平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和COI-1的表达，从而缓解纤维化[2].COL-1是细胞外基质的主要成分，也是肝纤维化检测的标志物，同时也是HSCs活化的标志。TGF-B1信号通路与HSCs的活化密切相关[2)，下调TGF-1的表达可抑制HSCs活化[3]。有研究报道小柴胡汤显著抑制日本血吸虫感染小鼠肝脏TGF-B1，热休克蛋白47(HSP47)、a-SMA，COI-1和11型胶原(COL-11)的表达，从而缓解血吸虫感染引起的肝纤维化[

　　现有研究表明，多种中药在肝纤维化的治疗中具有显著疗效，并已应用于临床[26])。中药软肝方(当归、白芍、丹参、茜草、薏故仁、茯苓等)对于改善乙型肝炎肝硬化、肝纤维化水平疗效显著[2]。扶正化瘀胶囊(丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉等)可显著改善日本血吸虫病肝纤维化患者的肝功能，并在一定程度上降低肝纤维化指标[3]，小柴胡汤联合干扰素a治疗乙型肝炎纤维化疗效显著，且可显著改善T细胞免疫状态[3]。加味小柴胡汤治疗酒精性肝纤维化，不但可改善患者临床症状与体征及肝功能，而且能有效降低血清肝纤维化指标，促进肝脏组织修复，对酒精性肝纤维化疗效较好，总有效率达86.67%。小柴胡汤作为一种传统中药方剂，在酒精性肝纤维化、乙型肝炎肝纤维化的治疗中表现出良好的抗纤维化、抗炎效用。本研究观察了小柴胡汤对体外培养LX-2细胞的作用，细胞形态学观察、MTT以及Edu细胞增殖结果显示，小柴胡汤可以抑制LX-2细胞的增殖，且存在明显的量效关系，提示其可作为血吸虫病肝纤维化的潜在治疗药物。同时，经不同浓度小柴胡汤处理后COL-ImRNA表达水平也显著降低，说明小柴胡汤可通过抑制HSCs活化和增殖并降低COI-1在肝星状细胞中的表达来发挥其抗纤维化活性，具有潜在的药用价值。但关于小柴胡汤通过抑制肝星状细胞增殖进而达到延缓血吸虫肝纤维化的具体机制尚不十分明确，有待进一步研究。

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