一种多菌灵酶联免疫快速检测方法的建立

　　摘要：利用酶联免疫吸附法原理建立了一种能够定量测定果蔬、茶叶、烟叶中多菌灵残留量的方法。通过酸碱中和化学反应，制备多菌灵半抗原，再通过免疫小鼠筛选出抗多菌灵单克隆抗体，制得酶标羊抗鼠抗抗体，并将制备出的抗多菌灵单克隆抗体和酶标羊抗鼠抗抗体用于酶联酶联免疫试剂盒的研制。结果表明，在0.1~8.1 ug/L的线性范围内，目标物多菌灵线性关系良好，相关系数(R2)

　　可达到0.995。在300，600，1 200 ug/kg 3个添加水平下试剂盒的回收率为76.0%~102.2%，相对标准偏差均小于10%。试剂盒栓测烟叶、苹果、白菜、茶叶样本中的多菌灵，检测限依次为266.3，421.0，349.1，484.4 pg/kg(n=20)。该方法属于快速检测方法，适用于果蔬、茶叶、烟叶中多菌灵残留量的测。

　　关键词：多茵灵;单克隆抗体;ELISA试剂盒

　　Abstract: Using the principle of enzyme-linked immunosorbent assay, a method for quantitative determination of carbendazim residues in fruits, vegetables, tea, and tobacco was established.

　　First, the carbendazim hapten was prepared through acid-base neutralization chemical reaction, and then the antrcarbendazim monoclonal antibody was screened out by immunizing mice to prepare the enzyme-labeled goat anti-mouse anti-antibody, and finally the prepared anti-carbendazim Monoclonal antibodies and enzyme-labeled goat anti-mouse antrantibodies were used in the development of enzyme-linked ELISA kits. The results showed that within the linear range of 0.1~8.1 ug/L., the target carbendazim had a good linear relationship, and the correlation coefficient (R2) could reach 0.995. The recoveries of the kits at the addition levels of 300, 600, and 1 200 g/kg were 76.0%~102.2%, and the relative standard deviations were all less than 10%. The kit detected carbendazim in tobacco leaves, apples, cabbage, and tea samples, and the detection limits were 266.3,421.0, 349.1, and 484.4 ug/kg (n = 20). This method was a rapid detection method and suitable for the determination of car bendazim residues in fruits, vegetables, tea, and tobacco leaves.

　　Keywords: carbendazim: monoclonal antibodies; enzyme linked immunosorbent assay kit

　　多菌灵(carbendazim)即N-2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯，属于苯并呲唑类，是一种病害防治杀菌剂，被广泛应用于农作物。然而施用多菌灵的目标物会长期残留该药物，人、畜食用后，会引起头晕、恶心、呕吐、抽搐等一系列中毒症状[-2].

　　GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了果蔬、茶叶中多菌灵的最大残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)范围为：0.02 ~5.00 mg/kg。目前中国的检测标准有：GB/T 5009.188-2003《蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定》、GB/T23380-200%水果、蔬菜中多菌灵残留的测定 高效液相色谱法》，SN/T 3650-2013《药用植物中多菌灵、噻菌灵和甲基硫菌灵残留量的测定 液相色谱一质谱/质谱法》、SN/T 0162-2011《出口水果中甲基硫菌灵、硫菌灵、多菌灵、苯菌灵、噻菌灵残留量的检测方法 高效液相色谱法》、SN/T 1753-2016《出口浓缩果汁中甲基硫菌灵、噻菌灵、多菌灵和2-氨基苯并咪唑残留量的测定 液相色谱一质谱/质谱法》、SN/T 0220-2016《出口水果中多菌灵残留量的检测方法》、NY/T 1680-2009《蔬菜水果中多菌灵等4种苯并咪唑类农药残留量的测定 高效液相色谱法》、NY/T 1453-2007《蔬菜及水果中多菌灵等16种农药残留测定 液相色谱一质谱一质谱联用法》。上述标准均为仪器分析法，同时，通过查阅文献发现，前人研究多菌灵检测方法较多地偏重仪器方法，已报道的仪器方法有：超高效液相色谱法[3]、QuEChERS-高效液相色谱法(-3]、液相色谱一质谱/质谱法[6]、紫外分光光度法["]、液相色谱法-]、高效液相色谱法[o-1，、SERS法[2]等，分析对象主要为蔬菜、水果。此外，也有报道[13-1])利用酶联免疫法快速检测多菌灵的残留量，但分析对象为土壤和水，目前尚未检索到农产品中检测多菌灵残留量的快速检测方法。而且仪器分析法成本高、步骤复杂，对检测人员有较高的技术要求，不便于基层实验室和中小型生产企业实施检测。因此，研究拟采用酶联免疫吸附法对烟叶、苹果、白菜、茶叶中多菌灵残留量进行检测，以期提供一种成本低、效果好的方法，为农药残留监管提供技术支撑。

　　1材料与方法

　　1.1 材料与仪器

　　多菌灵、噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑标准品：纯度>95%，北京标准物质研究中心;牛血清白蛋白：纯度>98%，美国Sigma公司;卵清蛋白：纯度>98%，美国Sigma公司;三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸铵、氢氧化钠、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化锡、碳二亚胺、石油醚、硫化铵、二甲基甲酰胺、碳酸钾：分析纯，北京百欣试剂公司;果蔬、茶叶、烟叶：市售;Balb/c小鼠：斯贝福(北京)生物技术有限公司;单克隆杂交瘤细胞株：实验室自制;酶标仪：MK3型，上海雷勃分析仪器有限公司。

　　1.2抗原制备

　　1.2.1 半抗原制备 取三氟乙酸20 mL.加三氟乙酸酐2 mL，冰水浴至0℃，加硝酸铵0.5 g，搅拌1h，加入含多菌灵1.0 g的三氟乙酸溶液，继续搅拌反应2h。停止搅拌，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加200 ml.

　　二氯甲烷萃取，加水300 mlL，充分搅拌，转入分液漏斗中，静置30 min，分层，分去上层水相，所得二氯甲烷溶液，旋蒸(40 ℃)，50 mL.乙醚打浆，得到化合物a 0.76 g.收率67%[]。在上述三氟乙酸和三氟乙酸酐体系下，用硝酸铵对多菌灵进行硝化反应，在苯环上引入硝基，萃取前进行中和，便于萃取.'H NMR(CDCl，，300 MHz)o：8.31(1H，dd.J=1.616，=1.239)，.7.69(1H，dd，J=8.716，J=1.616)，7.64(1H，dd，J=8.716.J=1.239)，3.85(3H，s)取化合物a 0.7g用乙醇溶解，加含0.43 g氯化锡的水溶液10 mL，通入氮气，加热回流反应3h;旋蒸(60 ℃)、除去乙醇，加水200 mlL，加乙酸乙酯100 mL，充分搅拌，静置，分去水相，有机相旋蒸(55 ℃)以除去大部分乙酸乙酯，利用石油醚-乙酸乙酯(V石艇：VZ酸乙脂=

　　1：1)对其进行洗脱分离，得到b产物(半抗原化合物)0.54 g，收率为83%.'H NMR(CDCla，300 MHz)0：3.79(3H，s)，6.27(2H，s)，6.90(1H.dd.J=2.225.J=1.850)，6.46(1H，dd.J=8.422.J=2.225)，7.34(1H，dd.J=8.422.1=1.850)，5.00(1H，s)，9.15(1H，s)，上述产物经核磁共振氢谱测定，在化学位移8=6.27处存在苯环上芳香胺的共振吸收峰，说明半抗原合成成功。多菌灵半抗原合成路线见图1.

　　1.2.2 免疫原制备 称取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mlL.0.1 mol/L，磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中得到溶液A;用0.2 mL H20溶解1-(3二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺盐酸盐和N-A基琥酰亚胺各30 mg，加入至溶液A中，搅拌30 min;取15 mg半抗原，溶解于1 ml.二甲基甲酰胺溶液中，然后缓慢加入到溶液A中溶解，搅拌24 h。透析后分装，-20℃保存。

　　1.2.3 包被原制备 称取卵清蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL.0.1 mol/L，磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中，得到溶液B;用0.2 mL.H20溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N羟基琥珀酰亚胺各30 mg，加入至溶液B中，搅拌30 min;取13 mg半抗原，溶解于1ml.二甲基甲酰胺中，然后缓慢加入到溶液B中溶解，搅拌

　　24 h，透析后分装，-20℃保存。

　　1.3 酶标记抗抗体制备

　　利用1.2得到的免疫原免疫Balb/c，制备杂交瘤细胞株，纯化出多菌灵单克隆抗体[1]，免疫无病原体羊，得到羊抗鼠抗抗体[7，再用辣根过氧化物酶进行标记[]，得到标记抗抗体。

　　1.4 抗原包被浓度、单克隆抗体浓度选择及酶标板制备(1)备抗依次进行1：2 000.1：4 000，18000的梯度稀释，对制备的单克隆抗体依次进行1：10 000，1：20 000，1：40 000，1：80 000的梯度稀释，测定波长为450 nm，按式(1)计算百分吸光率。к-× 100%，

　　(1)式中：K--百分吸光率，%;B--标准品或样本溶液的平均吸光度值;B--0 ug/L，标准溶液的平均吸光度值。

　　(2)包被酶标板的抗原包被液体积为100 pL，需在37℃下孵育2h，再加入150 pL 0.02 mol/L PBS缓冲液，其中牛血清白蛋白的质量分数为0.05%，37℃下孵育2 h[13]，即完成酶标板制备。

　　1.5 烟叶中多菌灵残留量测定

　　利用RIDAWIN数据分析软件建立标准曲线，分别以待测药物的标准品浓度、Logit(B/B，)为标准曲线的横、纵坐标，将待测样本的吸光度值代入该曲线，即可测定出多菌灵残留量。

　　1.6 关键指标检测

　　1.6.1 检测限 取20份经过确证的空白样本，利用1.5的方法检测样本浓度，并计算20份样本浓度的标准差，所测样本浓度的平均值与其3倍标准差之和即为检测限[00)

　　1.6.2 精密度和准确度 将多菌灵标准品添加至烟叶样本，添加浓度分别为300，600，1 200 ug/kg，检测3个浓度的烟叶样本回收率。烟叶样本做4个平行，计算相对标准偏差(RSD).

　　1.6.3 稳定性 将试验制备的试剂盒于4℃下存放，每月固定日期测定最大吸光度值(O yg/L)、试剂盒1Cso以及烟叶样本的回收率，连续测定12个月。

　　1.6.4 抗体特异性 噻苯达唑、甲基托布津、托布津、

　　2-氨基苯并咪唑与多菌灵的结构类似，测定上述药物的ICso，根据式(2)计算噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反应率。引起50%抑制的多菌灵浓度与引起50%抑制的多菌灵类似物浓度的百分比，即为交叉反应率。

　　2结果与分析

　　2.1 抗原包被浓度、单克隆抗体浓度选择测定浓度为0.0.0.1 yg/L的多菌灵标准品的吸光度值(见表1)，根据式(1)计算B(0.1 ug/L)/B，(0.0 g/L)

　　的百分吸光率。理论上在抗原数量一定的情况下，抗体只有达到一定数量才能有效结合，然而实际应用中，抗原和单克隆抗体作为制备酶联免疫试剂盒的最关键原料，理想情况是在能够保证有效反应的情况下，抗体量最小;稀释倍数越大，同样产量的原料能够制备的试剂盒就越多。根据已有的研究[2]，如果能够达到B(0.1 1g/L)/B

　　(0.0 yg/L)的百分吸光率在70%~85%的要求，那么稀释倍数越大，原料就能节省得越多。因此，选择抗原稀释倍数为8000，单克隆抗体稀释倍数为80 000。

　　2.2 标准曲线

　　利用RIDAWIN数据分析软件建立标准曲线(见图2)，标准曲线的范围为0.0~8.1 ug/L，试剂盒的半数抑制浓度(ICso)为0.851 ug/L;得到的线性方程为：y=-1.686x+1.117，决定系数R2为0.995.

　　2.3 检测限

　　由表2可知，该方法对烟叶、苹果、白菜及茶叶样本的检测限分别为266.3，421.0，349.1，484.4 ug/kg。优于吴燕等[2]针对茶叶建立的基于表面增强拉曼光谱测定方法(定量限为2000 g/L)，GB 2763-2019食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了多菌灵对苹果、白菜、茶叶的最大残留限量均为5 mg/kg(暂未对烟叶进行规定)。因此，该方法能够满足对多菌灵的检测要求。

　　2.4 精密度和准确度

　　由表3可知，不同添加水平多菌灵的烟叶样本的回收率为76.0%～102.2%，批内相对标准偏差为 4.8% ～9.7%，批间相对标准偏差为8.0%～8.6%。酶 联 免 疫 试剂盒的准确性与 精 密 度 有 关，批内与批间的相对标准偏差均在10%以内，能保证测试的准确性。

　　2.5 稳定性

　　由表4可知，试剂盒于4 ℃保存能够正常检测12个 月，试验期间其最大吸光度值 (0μg/L)范 围 为 1.59～1.91，IC50范围为0.367～0.772μg/L，烟叶样本的回收率范围为72.6%～95.3%，均未显示异常。说明该酶联免疫试剂盒的稳定性良好，在4 ℃下能够保存12个月。

　　2.6抗体特异性

　　噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑为应用广泛的杀菌剂。通过测定多菌灵抗体与噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反应率，发现多菌灵抗体与噻苯达唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反应率<1%，说明多菌灵抗体的特异性良好。

　　3结论

　　试验建立了一种烟叶、苹果、白菜、茶叶中多菌灵残留的酶联免疫吸附方法，通过制备出特异性良好的多菌灵单克隆抗体，将其应用于酶联免疫试剂盒的制备。结果表明，该方法稳定性好，检测时间仅为45~60 min，并且不需要昂贵的仪器，适用于基层实验室对烟叶、苹果、白菜、茶叶中多菌灵残留量进行批量检测。GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定了多菌灵对6种谷物、4种油料油脂、16种蔬菜、28种水果等食品类别的最大残留限量，而试验研究样本仅限于苹果、白菜等果蔬，今后可根据市场需求，结合该标准对样本进行拓展。

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