壳寡糖抑菌性能的研究

　　摘要：采用牛津杯法和共培养法研究壳寡糖对鸡源、猪源大肠杆菌(Escherichia coli 和沙门民菌(Salmonella)及乳酸菌的抑制作用。结果表明，牛津杯法未检测到壳寡糖对病原菌的抑制作用;共培养法证实质量浓度为0.1 gmlL.0.2 g/mL和0.5 g/mL的壳寡糖对鸡源、猪源大肠杆菌和沙门氏菌均具有显著的抑菌作用(P<0.05)，且随着壳寡糖质量浓度的升高，抑菌能力逐渐增强 0.2 g/mL的壳寡糖与乳酸菌共培养24 h对乳酸菌活菌数的影响不显著(P>0.05)。为开发具有抑制畜禽肠道病原菌生长、预防腹泻等作用的复合壳寡糖乳酸菌产品提供理论基础。

　　关键词：壳寡糖：抑菌作用：大肠杆菌：沙门氏菌;乳酸菌：共培养法

　　Abstract: The inhibitory effects of oligochitosan on Escherichia coli, Salmonella and lactic acid bacteria from chicken and pigs, were studied by Oxford cup method and co-culture method. The results showed that the inhibitorv effect of oligochitosan on pathogens was not detected by Oxford method. The co-culture method suggested that oligochitosan could significantly inhibit E. coli and Salmonella at the concentration of 0.1 g/ml, 0.2 g/ml and 0.5 g/ml, respectively

　　(P<0.05), and with the increase of oligochitosan, the antibacterial effect was improved gradually. There was no significant effect on the number of viable lactic acid bacteria (P>0.05) when 0.2 g/ml oligochitosan was co-cultivated with lactic acid bacteria for 24 h. It provided a theoretical basis for the development of composite oligochitosan-lactic acid bacteria products that could inhibit the growth of pathogenic bacteria in the intestinal tract of livestock and poultrv and prevent diarhea.

　　Key words: oligochitosan; antibacterial effect; Escherichia coli; Salmonella; lactic acid bacteria; co-culture methoc

　　壳聚糖是一种广泛存在于自然界中，由虾、蟹、昆虫的几丁质外壳经过不同程度地脱乙酰基而得到的一种无毒聚氨基葡萄糖"。壳寡糖(B-1，4寡糖-葡萄糖胺)是壳聚糖经物理、化学或特殊的生物酶降解得到的一种聚合度在2~20之间的寡糖产品，其水溶性好、功能作用大和生物活性高2。壳寡糖是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基寡糖，绿色天然、无副作用，已经成为国际上新兴的功能性低聚糖。壳寡糖由于易于吸收，功效显著，已经作为生物保鲜剂 和饲料添加剂广泛应用在医药领域、食品领域、化妆品领域和水产养殖领域等，主要用于降血脂、抗癌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等。

　　杨焕蝶等17研究发现，壳聚糖对大肠杆菌(Escherichia coli具有较好的抑菌作用，且较低的乙酰度和pH值更有利于壳聚糖发挥其抑菌活性。钱建瑛等研究发现，降低pH值、提高脱乙酰度和提高壳寡糖溶液浓度等能够提高壳寡糖的抑菌活性。目前，壳寡糖作为功能性低聚糖也被广泛应用在畜禽养殖中，研究发现壳寡糖能够增殖有益菌，抑制有害菌生长，调节机体肠道微生态平衡。壳寡糖的抗菌性能是光谱性的，已有不少学者对其抑菌抗菌M、抗病毒11和抗肿瘤1等进行了研究。冯文娟等[2研究发现，壳寡糖对大肠杆菌、白色念珠菌(Candida albicans)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有良好的抑菌活性，对大肠杆菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)均为6.5g/L;对枯草芽孢杆菌的MIC和MBC均为1.5gL;钱建瑛等 研究发现，当壳寡糖质量浓度>5 mg/mL之后，抑菌效果与同质量浓度苯甲酸钠相近，降低pH值、提高脱乙酰度、提高壳寡糖溶液质量浓度等都能提高壳寡糖的抑菌活性。目前，随着国家对抗生素的使用要求越来越严格以及环保的压力，在畜牧养殖领域，壳寡糖作为一种天然的免疫增强和炎症调节活性物质，在增强动物免疫机能和抗炎方面具有较高的价值和应用前景"。

　　本研究采用牛津杯法和共培养法研究壳寡糖对鸡源、猪源大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella)的抑菌作用以及壳寡糖对乳酸菌生长的影响，以期为开发壳寡糖和乳酸菌复合产品提供理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料与试剂

　　1.1.1主要试剂

　　壳寡糖(聚合度2~10，分子质量<2000 Da，纯度为80%)：山东卫康生物医药科技有限公司;氯化钠(分析纯：天津博迪化工股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.1.2培养基

　　营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、木糖赖氨酸去氧胆酸盐(xylose lysine deoxycholate，XLD)琼脂培养基：青岛海博生物技术有限公司。

　　1.1.3菌株

　　病原菌(鸡源大肠杆菌菌株BLCC8-0102、鸡源沙门氏菌菌株BLCC8-0104、猪源大肠杆菌菌株BLCC8-0001和猪源沙门氏菌菌株BLCC8-0063)：从患病畜禽病料中分离、鉴定，保存于本实验室;乳酸菌菌株BLCC2-0015和BLCC2-0126：山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院。

　　1.2仪器与设备

　　HPX-9082MBE电热恒温培养箱：上海博迅实业有限公司：SW-CJ-2F(2)超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司：DHG-9140A电热鼓风干燥箱：常州诺基仪器有限公司：HH4恒温水浴锅：国华电器有限公司：THZ-C恒温振荡器：扬州培英实验仪器有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1牛津杯法测定壳寡糖对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用

　　分别将大肠杆菌和沙门氏菌以无菌操作稀释一定倍数，取0.1mL均匀涂布于营养琼脂培养基，放入牛津杯，每个杯中分别注入质量浓度为0.02 g/mL、0.10 gmL、0.20 g/mL和

　　0.50g/mL的壳寡糖溶液0.2 mL，37℃条件下培养24h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，设置营养肉汤培养基为阴性对照[13)

　　药敏试验判定标准：当抑菌圈直径>15 mm时为高敏;介于10~15mm之间时为中敏：<10mm时为低敏

　　1.3.2共培养法检测壳寡糖对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用

　　病原菌菌液的制备：从斜面挑取1环病原菌菌苔接种到营养肉汤培养基，装液量为50mL/250 mL，于37 ℃C、180r/min条件下振荡培养24 h，备用。

　　在营养肉汤培养基中分别添加质量浓度为0(空白细)、

　　0.02 g/mL.0.10 g/mL、0.20 g/mL和0.50 g/mL的壳寡糖，同时按1%(V/V的接种量接入培养好的病原菌菌液，37℃180r/min条件下振荡培养，分别于2h和8h取样检测病原菌活菌数，大肠杆菌接种于伊红美兰琼脂培养基，37℃条件下培养24 h进行菌落计数：沙门氏菌接种于XLD培养基，37 ℃条件下培养48h进行菌落计数。大杆菌按照GBT18869-2002《饲料中大肠菌群的测定》进行菌落计数：沙门氏菌按照GB 4789.4-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行菌落计数。

　　1.3.3壳寡糖对乳酸菌的抑菌作用

　　乳酸菌菌液的制备：从斜面上挑取1环乳酸菌菌苔接

　　种到MRS肉汤培养基，装液量为250 mL/250 mL，37℃静置培养24 h，备用。

　　在MRS肉汤培养基中分别添加质量浓度为0(空白组)、

　　0.2 g/mL和1.0 gmL的壳寡糖，同时按照2%(VV的接种量接入上述准备好的乳酸菌菌液，于37℃条件下静置培养，培养8h和24h时取样检测乳酸菌活菌数，检测方法按照GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》进行。

　　1.3.4数据处理与分析

　　试验数据用Excel 2013软件进行初步处理后，采用SPSS

　　13.0进行统计分析，采用One-way ANOVA进行方差分析，最小显著差异(least significant difference，LSD)法进行组间多重比较，结果以“平均值土标准差”表示，P<0.05表示差异显著。

　　2结果与分析

　　2.1壳寡糖对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用2.1.1牛津杯法检测壳寡糖对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用

　　采用牛津杯法检测壳寡糖对鸡源和猪源大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用，均未检测到抑菌圈。

　　2.1.2共培养法检测壳寡糖对鸡源大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用

　　沙门氏菌和大肠杆菌是两种重要的人畜共患病致病菌，严重威胁畜禽健康、食品安全、人类健康和公共安全。大肠杆菌普遍存在于人类和畜禽肠道内，大部分血清型作为肠道内的共生菌是没有毒性的，仅少数血清型的大肠杆菌具有致病性，可引起严重的肠道感染，给畜禽业造成严重损失。我国沙门氏菌有290多种血清型，不同血清型的沙门氏菌的致病性存在差异，能够引起伤寒、副伤寒以及胃肠道疾病等。我国每年因沙门氏菌食物中毒的发病人数达300万人次，其中近半数与生鸡肉交叉污染有关。壳寡糖具有良好的药理学作用和安全性以及多种有益的生物学活性，其中对炎性信号传导通路的抑制被认为是其发挥抗炎作用的主要机制"。采用共培养法检测壳寡糖对鸡源大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用，结果见表1。

　　由表1可知，壳寡糖对鸡源大肠杆菌的抑制作用：培养2 h时，与空白组相比，壳寡糖组除0.02 g/mL质量浓度外，大肠杆菌活菌数均显著降低(P<0.05);培养8h时，与空白组相比，4个壳寡糖组大肠杆菌活菌数均显著降低(P<0.05)，且随着壳寡糖质量浓度的升高，抑菌能力逐渐增强。壳寡糖对鸡源沙门氏菌的抑制作用：培养2h时，与空白组相比，

　　4个壳寡糖组沙门氏菌活菌数均显著降低(P<0.05)，且随着壳寡糖质量浓度的升高，抑菌能力逐渐增强;培养8h时，与空白组相比，壳寡糖组除0.02 g/mL质量浓度外，沙门氏菌活菌数均显著降低(P<0.05)。有研究发现，在固体培养基中进行壳寡糖的抑菌试验，发现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌等有害菌具有抑制作用7。本试验结果与已有研究一致，壳寡糖在抑制大肠杆菌和沙门氏菌方面效果显著，具有抗炎作用。

　　2.1.3共培养法检测壳寡糖对猪源大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用

　　由表2可知，壳寡糖对猪源大肠杆菌的抑制作用：培养2 h时，与空白组相比，壳寡糖组除0.02 gmL质量浓度外，大肠杆菌活菌数均显著降低(P<0.05);培养8h时，与空白组相比，4个壳寡糖组大肠杆菌活菌数均显著降低(P<0.05)。

　　壳寡糖对猪源沙门氏菌的抑制作用：培养2h时，与空白组相比，壳寡糖组除0.02 g/mL质量浓度外，沙门氏菌活菌数均显著降低(P<0.05);培养8h时，与空白组相比，4个壳寡糖组大肠杆菌活菌数均显著降低(P<0.05)，且随着壳寡糖质量浓度的升高，抑菌能力逐渐增强。

　　2.2壳寡糖对乳酸菌的抑制作用

　　大量研究表明，壳寡糖能够改善动物肠道微生态环境，提高营养物质的消化吸收，促进动物生长。乳酸菌在调节免疫功能方面的机制尚不完全清楚，但其具有与有害菌竞争性排斥、产生抗菌物质和调节免疫反应的功能10目前，关于壳寡糖对乳酸菌抑制作用的报道较少，祁东风等1研究发现壳寡糖可抑制有害菌增殖，增加优势菌群含量。但纪小敏等P研究发现，壳寡糖对保加利亚乳杆菌(Lactobacilus bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus的生长活性具有一定的抑制作用。本试验通过共培养法检测壳寡糖对乳酸菌的抑制作用，结果见表3。

　　由表3可知，壳寡糖对乳酸菌BLCC2-0015的抑制作用：培养8h时，与空白组相比，壳寡糖的添加，使得乳酸菌活菌数显著降低(P<0.05);培养24h时，与对照组相比，添加

　　0.20 gmL的壳寡糖对乳酸菌活菌数影响不显著(P>0.05)，添加0.50 g/mL的壳寡糖可显著降低乳酸菌活菌数(P<0.05。壳寡糖对乳酸菌BLCC2-0126的抑制作用：培养8h和24h时，空白组相比，添加0.2 gmL的壳寡糖对照乳酸菌活菌数影响不显著(P>0.05)，添加0.50 g/mL的壳寡糖显著降低乳酸菌活菌数(P<0.05)。刘媛媛等[2研究发现，壳寡糖能增加断奶仔猪有益微生物数量。但也有研究发现，日粮中添加250 mg/kg的壳寡糖能降低回肠中乳酸杆菌和大肠杆菌数量，显著降低乳酸浓度2。本研究中0.5 g/mL的壳寡糖对乳酸菌具有抑制作用，0.2 g/mL的壳寡糖与乳酸菌共培养24h时对乳酸菌活菌数没有影响，不具备抑制作用，说明

　　0.2 g/mL的壳寡糖与乳酸菌可以共同使用，不会产生抑制作用。

　　3结论

　　牛津杯法未检测出壳寡糖对病原菌的抑制作用;共培养法证实质量浓度为0.1 g/mL.0.2 g/mL和0.5 g/mL的壳寡糖对鸡源、猪源大肠杆菌和沙门氏菌均具有显著的抑菌作用(P<0.05)，且随着壳寡糖质量浓度的升高，抑菌能力逐渐增强：0.2 gmL壳寡糖与乳酸菌共培养24 h对乳酸菌活菌数的影响不显著(P>0.05)。

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