肝素钠二糖结构高效液相检测方法的研究

　　摘要 肝素的结构通常以不同的二糖单位表示，了解肝素二糖的组成有助于从微观结构上解析肝素的作用机理。采用肝素酶1、1、混合，在合适的温度及缓冲液条件下，共同酶解肝素溶液，肝素酶解后得到的二糖及寡糖由于其磺酸化程度的不同因而在阴离子交换柱上保留的程度不同，已达到分离的效果，通过二糖标准品对肝素酶解后的二糖及寡糖进行定位，进而确认肝素酶解后不同糖的构成比例。结果表明，肝素结构测定检测方法具有较好的精密度，在分别改变柱温、体积流量时具有较好的耐用性，该检验方法可用于肝素二糖结构的解析。

　　关键词 肝素钠;二糖;肝素酶：阴离子交换

　　肝素钠是黏多糖硫酸酯类抗凝血药[，由猪或牛的肠黏膜中提取获得，近年来研究证明肝素钠还有降血脂作用。肝素由一个糖醛酸和一个葡糖氨组成的二糖交替形成的线状硫酸化的多糖，隶属于糖胺聚糖家族。组成肝素的醛酸为L-艾杜醛酸(HdoA)和D-葡萄糖醛酸(GleA)，而氨基糖为D-氨基葡萄糖(GleN)，IdoA和GleN通过a+，4糖苷键进行连接，而GlcA则通过B-，4糖苷键进行连接[2.GleN普遍地以N-硫酸化的形式存在于肝素中，但少数序列中含有N乙酰化(Acetyl)的GleN。几乎所有的醛酸和氨基糖都有0疏酸基团。肝素的结构通常以不同的二糖单位表示，而其中最主要的是三磺酸化的二糖(TSD)：IdoA2503-Gle-

　　N5036503，其葡萄糖胺片段主要是N-疏酸化的。肝素钠经肝素酶酶解成二糖、四糖等不同的寡糖结构，通过阴离子交换柱分离呈现肝素中不同的寡糖比例，从而了解肝素的组成成分。

　　1仪器与试药

　　1.1仪器与器具

　　高效离子色谱仪(Dionex ICS5000，编号F079);电子分析天平(梅特勒托利多XS204，AB265-与，编号H020);移液器(规格100 ~1 000 L，编号YP26：规格20 ~200L，编号YP31)。

　　1.2 试剂与试药

　　磷酸二氢钠、高氯酸钠、磷酸(国药集团化学试剂有限公司)，分析纯磷酸二氢钾、氢氧化钾、醋酸钙、醋酸、氢氧化钠、硼氢化钠(国药集团化学试剂有限公司)：分析纯牛血清蛋白(Sigma公司)。肝素酶1、11、111苏州国销医药科技有限公司，批号分别为20130801，20130802，20130803);肝素二糖(来源：Dextra科技公司，A IA：批号CCDX69-

　　163A：AII A：批号CCDX69498：A II A：批号CCDX6947B;ANA：批号CCDX69-81B;A IS：批号CCDX111-52;AI1：批号CCDX69490;A II：批号CCDX69-74B;AIVS：批号CCDX111-81A)。

　　2测试方法

　　2.1 测试原理

　　该检验方法采用肝素酶1、11、1混合，在合适的温度及缓冲液条件下，共同酶解肝素溶液，肝素酶解后得到的二糖及寡糖由于其磺酸化程度的不同因而在阴离子交换柱上保留的程度不同，已达到分离的效果，通过二糖标准品对肝素酶解后的二糖及寡糖进行定位，进而确认肝素酶解后不同糖的构成比例。

　　2.2色谱条件

　　分析柱：戴安lonPac AS11-HC，4 mm*250 mm，编号117;保护柱：戴安IonPac AG11HC，4 mm*50 mm，编号116：流动相A：称取0.280 g磷酸二氢钠溶于950 mL纯化水中，用磷酸调pH至3.0，后用纯化水稀释至1000 mL，0.22 um滤膜滤过。流动相B：称取140 g高氯酸钠溶于950 mlL.流动相A中，用磷酸调pH至3.0，后用流动相A稀释至1 000 mL，0.22 um滤膜滤过。检测波长：234 nm;体积流量：0.45 mL/min;柱温：35 ℃;进样量：10LL：梯度洗脱条件见表1

　　2.2.1 测试用溶液 pH 7.0乙酸钙溶液：称取32 mg乙酸钙和10 mg牛血清蛋白溶于60 ml.纯化水中，加入580 L冰乙酸，定容至100ml.

　　pH 7.0磷酸二氢钾缓冲液：称取68mg磷酸二氢钾和10 mg牛血清蛋白溶于30 ml.纯化水中，定容至50 mL。硼氢化钠溶液：称取12mg硼氢化钠溶于400u纯化水。肝素酶1溶液：用pH 7.0磷酸二氢钾缓冲液溶解稀释肝素酶1使成0.4 U/mL.肝素酶11溶液：用pH 7.0磷酸二氢钾缓冲液溶解稀释肝素酶11使成0.4 1U/mL.肝素酶ⅢI溶液：用pH 7.0磷酸二氢钾缓冲液溶解稀释肝素酶I使成0.4 1U/mlL.肝素酶1，11，1溶液：肝素酶1溶液、肝素酶11溶液、肝素酶ⅢI溶液1：1：1混合。二糖标准溶液：将Al A.AIIA.AIIA.ANA.A IS，AIIS、AIISAIS8种二糖分别用纯化水配制成0.25 mg/mL的溶液。空白溶液：吸取20 uL.纯化水、70 uL pH7.0乙酸钙溶液及100 uL肝素酶1，11，1溶液混合，制成混合溶液。对照品溶液：称取适量肝素钠对照品，制成浓度为20 mg/mlL的水溶液：吸取20 uL该溶液，分别加入70 uL pH7.0乙酸钙溶液及100肝素酶1，11，I溶液混合，制成混合溶液。供试品溶液：称取适量肝素钠供试品，制成浓度为20 mg/mL的水溶液;吸取20山该溶液，分别加入70uL pH7.0乙酸钙溶液及100山肝素酶1，I1，1溶液混合，制成混合溶液。

　　2.2.2 肝素中寡糖含量的确定 取二糖溶液、空白溶液、供试品溶液分别进样，记录色谱图。

　　根据二糖溶液色谱图中二糖的出峰位置确认供试品中各峰，另出峰时间为9.5 min和23.5 min左右的分别为LR峰和四糖峰。

　　将已定位出的各个寡糖进行磺酸化程度的分类：分为一磺酸化区、二磺酸化区和三磺酸化区，根据峰面积归一化法计算一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及LR和四糖峰面积占总峰面积的比例，以此比例视为各组分的含量。

　　3结果分析

　　3.1重复性

　　按2.2.1配制供试品溶液，供试品溶液配制6份，分别进样，记录色谱图，计算供试品溶液中LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量。

　　测试结果见表2。

　　结论：实验员(A)6份供试品溶液测得LR含量的RSD为6.1%、一磺酸化二糖含量的RSD为2.2%、二磺酸化二糖含量的RSD为0.6%、三磺酸化二糖含量的RSD为0.5%及四糖含量的RSD为0.3%，均小于10.0%，符合规定，重复性测试通过。

　　3.2 中间精密度

　　由实验员(B)对同一批肝素钠供试品进行测试，重新配制对照品溶液及6份供试品溶液，分别进样，记录色谱图，计算LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量。

　　实验员(B)6份供试品溶液测得LR含量的RSD为3.4%、一磺酸化二糖含量的RSD为0.5%、二磺酸化二糖含量的RSD为0.5%、三磺酸化二糖含量的RSD为0.5%

　　及四糖含量的RSD为1.0%，均小于10.0%。

　　实验员(A)和(B)之间测得LR含量的RSD为6.2%.

　　一磺酸化二糖含量的RSD为1.8%、二磺酸化二糖含量的RSD为0.6%、三磺酸化二糖含量的RSD为0.7%及四糖含量的RSD为0.7%，均小于15.0%。

　　3.3耐用性

　　3.3.1 溶液稳定性 将对照品溶液和供试品溶液室温放置，放置0，6，12，24 h后分别进样，记录色谱图。测试结果见表4，表5

　　结论：对照品溶液放置6h后，LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和0h测得含量相比，相对平均偏差分别为6.3%，0.9%，0.5%，0.1%，

　　0.7%;放置12 h后，测得含量和0h测得含量相比，相对平均偏差分别为6.3%，0.5%，0.4%，0.1%，0.7%;放置24 h后，测得含量和0h测得含量相比，相对平均偏差分别为

　　6.3%，1.7%，0.4%，0.2%，0.7%。供试品溶液放置6h后，LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和0h测得含量相比，相对平均偏差分别为4.7%，0%，0.1%，0.3%，1.3%;放置12h后，测得含量和0h测得含量相比，相对平均偏差分别为6.1%，0.8%，0.1%，0.4%，0.5%：放置24 h后，测得含量和0h测得含量相比，相对平均偏差分别为4.7%，

　　0.9%，0.4%，0.5%，1.3%.

　　对照品溶液与供试品溶液放置6，12，24 h后，LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和0h测得含量相比，相对平均偏差均小于10.0%，符合规定，该测试表明对照品溶液及供试品溶液室温放置24 h内稳定。

　　3.3.2 改变体积流量对测定结果的影响 将体积流量从0.45 mlL/min分别调整为0.40 mL/min和0.50 mL/min，充分平衡，取对照品溶液和供试品溶液，分别进样，记录色谱图。结果见表6，表7。

　　结论：体积流量0.40 mlL/min和0.50 ml/min时均符合系统适用性要求。体积流量0.40ml/min时，对照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为6.3%，0.2%，0.6%，0.1%，1.7%，供试品溶液测得含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为4.7%，

　　0.3%，0.5%，0.3%，1.3%;体积流量0.50 mlL/min时，对照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为6.3%，1.3%，0.2%，0.2%，1.3%，供试品溶液测得含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为4.7%，1.6%，0.3%，0.2%，1.8%，上述相对平均偏差均小于10.0%。

　　3.3.3 改变柱温对测定结果的影响 将柱温从35 ℃分别调整为33 ℃和37 ℃，充分平衡，取对照品溶液和供试品溶液，分别进样，记录色谱图，见表8，表9.

　　结论：柱温33 ℃和37 ℃时均符合系统适用性要求。柱温33℃时，对照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为9.1%，0.8%，0.3%，0.1%，

　　0.9%，供试品溶液测得含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为7.5%，0.5%，0%，0.5%，1.6%;柱温37℃时，对照品溶液LR、一磺酸化二糖、二磺酸化二糖、三磺酸化二糖以及四糖的含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为9.1%，1.7%，0.2%，0.2%，0.7%，供试品溶液测得含量和标准条件下测得含量相比，相对平均偏差分别为6.1%，0.8%，0.3%，0.3%，0.9%，上述相对平均偏差均小于10.0%。

　　4讨论

　　肝素结构测定检测方法具有较好的精密度，在分别改变柱温、体积流量时具有较好的耐用性，该检验方法满足检验要求，可以用于肝素结构的测定。今后随着该方法使用的深入，将继续开发改进该方法，以满足对肝素钠二糖结构检测的质控要求。

　　参考文献

　　[1]姬胜利，桑青，张天民，肝素的来源控制、结构分析以及结构与生物活性关系的研究进展[J].中国药学杂志，2012，47(09)：660-663.

　　[2]张震，低分子肝素的结构确证研究[].中国新药杂志，2014，23(08)：901905 +939.

　　Abstract The structure of heparin usually is represented by different disaccharide units. It can help learn the mechanism of heparin in the microstructure by analysis of disaccharide structure. Mix the heparin enzyme 1, I1, I to decompose the heparin solution with an appropriate temperature and buffer solution. The retention degrees of acquired disaccharide and oligosaccharide are different in the anion exchange column because of different sulfonation degrees. So disaccharide and oligosaccharide can be separated. Ensure the location of disaccharide and oligosaccharide by disaccharide standard then calculate the percentage of different disaccharide and oligosaccharide unit after enzymolysis. The result shows that this test method is with qualified precision and robustness when changing column temperature and flow rate. So this method can be used to analyze the disaccharide structure of heparin.

　　Key words Heparin sodium, Disaccharide structure, Heparin enzyme, Anion exchange

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文章名称： 肝素钠二糖结构高效液相检测方法的研究

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