基于网络药理学和分子对接探讨舒眠胶囊治疗失眠的作用机制

　　摘要 目的：通过网络药理学和分子对接技术探究舒眠胶囊治疗失眠的作用机制。方法：以网络药理学为基础，对舒眠胶囊、失眠相关作用靶点进行筛选，应用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)和Swiss Target Prediction数据库预测舒眠胶囊靶点，应用GeneCards等5个数据库收集失眠相关靶点数据;运用STRING数据库、DAVID数据库、Cytoscape 3.5.1软件对药物和疾病的交集基因进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)、京都基因和基因组百科全書(KEGG)富集分析，并构建“有效成分-靶点-疾病”图，分析舒眠胶囊治疗失眠的作用机制;最终，利用Discovery Studio软件进行分子对接模拟验证。结果：舒眠胶囊通过35个活性成分作用于120个失眠相关靶点。主要通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、灯心草菲类衍生物8个主要活性成分，作用于PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6等14个核心靶点，通过调控Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、PI3K/AKT信号通路起治疗失眠作用。分子对接结果显示关键活性成分与核心靶点对接良好。结论：舒眠胶囊通过多靶点、多通路发挥抗炎作用，从而改善失眠。

　　关键词 舒眠胶囊;酸枣仁;失眠;网络药理学;分子对接;中成药;作用机制;炎症

　　失眠是以睡眠时长或深度不足为主症，患者自觉影响到白天功能及活动的一种主观感觉[1]。国际睡眠障碍分类第三版明确指出，慢性失眠在人群中的患病率为9% ～12%，中国睡眠研究会2017年发布的报告显示，我国失眠的患病率达38%，远高于世界平均水平[2]。失眠发病机制复杂，是心血管疾病、慢性疼痛综合征、抑郁、焦虑、糖尿病、肥胖和哮喘等疾病的危险因素之一[3]。当前对于失眠的治疗仍以药物干预为主，代表性药物为苯二氮 艹 卓 类药物，这类药物起效速度快，对失眠症改善明显，然而，长期使用该药物存在精神错乱、认知障碍、药物成瘾性和戒断反应等不良反应[4]。舒眠胶囊是一种中成药，由酸枣仁、柴胡、白芍、合欢皮、合欢花、僵蚕、蝉蜕和灯心草8味中药组成，因其较好的临床疗效和良好的依从性而被广泛应用于临床[5]。因此，探究舒眠胶囊治疗失眠的作用机制具有重要意义。

　　网络药理学基于人工智能和大数据背景，运用数据库搜索、计算机模拟等技术，整合已知的临床、实验数据，预测药物治疗疾病的成分、靶点和通路，揭示三者的相互关系网络，适用于中草药复杂作用机制的初步探究[6]。本研究采用网络药理学方法解释舒眠胶囊和失眠的网络关系，预测舒眠胶囊治疗失眠的调控机制，利用分子对接技术验证预测。基于网络药理学和分子对接探究舒肝解郁胶囊治疗失眠作用机制流程见图1。

　　1资料与方法

　　1.1舒眠胶囊化合物、作用靶点检索

　　通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https：//tcmspw.com)检索并筛选舒眠胶囊8味中药的有效成分和作用靶点，筛选条件为口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18，采用Swiss Target Prediction数据库及文献检索等方法进行补充检索，基于Unitprot数据库(https：//www.Unitprot.org/)将靶点蛋白转化为对应基因名。结合文献纳入原儿茶酸、儿茶醛、霉酚酸内酯等经文献报道的药物化合物[7-8]。

　　1.2疾病靶点预测

　　以“Insomnia”为关键词，检索GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)、在線人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https：//omim.org/)、Drugbank数据库(https：//www.pharmgkb.org/)、DisGeNET数据库(https：//www.disgenet.org/)、中医药整合药理学研究平台(Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine，TCMIP)(http：//www.tcmip.cn)查找失眠的相关靶点，去重后在Uniprot中转化为对应基因名。

　　1.3交集靶点的筛选

　　在微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn/)在线平台上分别录入1.1项下舒眠胶囊预测靶点和1.2项下失眠相关靶点，绘制韦恩图。

　　1.4蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

　　基于STRING数据库(https：//string-db.org/)获取1.3项下靶点蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，设置物种为人(homo sapines)，最高置信度>0.9，并利用Cytoscape 3.5.1软件分析PPI网络，用拓扑方法评估核心网络，以“节度值(Degree DC)大于2倍中位数”为筛选条件，满足筛选条件的靶点为舒眠胶囊发挥作用的核心靶点蛋白。

　　1.5基因本体富集分析和京都基因和基因组百科全书富集分析

　　对核心靶点进行基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，分析平台为DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)，分析结果以气泡图形式呈现，探究舒眠胶囊治疗失眠可能的作用机制。

　　1.6“有效成分-靶点-疾病”网络构建及分析

　　基于Cytoscape 3.5.1软件，构建舒眠胶囊中药组成、有效成分与作用靶点间相互作用的网络图，结合失眠相关靶点，形成舒眠胶囊与失眠相互作用的网络图，对后者所形成的“有效成分-靶点-疾病”网络进行分析评估，设置“节度值(Degree DC)>2倍中位数”，筛选舒眠胶囊治疗失眠症的主要活性成分。

　　1.7核心靶点的分子对接模拟验证

　　利用Discovery Studio软件，对1.4项下筛选出的核心靶点和1.6项下筛选出的关键活性成分进行分子对接模拟验证，二者的结构信息分别来源于RCSBPDB数据库(http：//www.rcsb.org/)和Pubchem数据库(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

　　2结果

　　2.1舒眠胶囊有效成分筛选

　　共收集到41个有效成分，297个药物靶点。见表1。875E204C-D465-43B7-946D-FEFA86E0F319

　　2.2疾病靶点采集

　　共得到失眠症相关基因1 295个。

　　2.3“药物-有效成分-靶点”网络模型的构建

　　舒眠胶囊药物-有效成分-靶点可视化网络包括346个节点，988条相互关系。图中的红色圆形、绿色菱形、蓝色三边形分别代表舒眠胶囊的8味中药，41个有效成分和297个药物靶点。见图2。

　　2.4交集靶点筛选

　　舒眠胶囊药物靶点297个和失眠相关靶点1 295个，取交集获得120个交集靶点。见图3。

　　2.5PPI关系网络分析

　　来自STRING平台(120个节点，380条边)，PPI enrichment p-value：<1.0e-16，average node degree：6.33，avg.local clustering coefficient：0.542。来自Cytoscape 3.5.1(105个节点、380条边)，节点越大，颜色越深，则Degree值越高。见图4。

　　获得14位靶点为核心靶点。Degree值排名前6位的靶点为APP、PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6，因APP靶点与失眠疾病的相关性过低，选取后5位靶点作为舒眠胶囊治疗失眠的关键靶点进行分子对接。见表2。

　　2.6GO富集分析及KEGG通路富集分析

　　结果显示，涉及的生物过程主要包括RNA转录、炎症反应、脂多糖介导的细胞反应等。见图5。

　　前10位通路的 P 值(富集显著性)均小于0.05，表示分析可信度高。其中，Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B，PI3K/AKT)信号通路与失眠发生机制密切相关，且3条通路均为炎症相关通路。PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6均出现在Toll样受体信号通路，APP未富集在前10位通路中。见图6。

　　2.7“舒眠胶囊有效成分-失眠-靶点”网络模型的构建及分析

　　舒眠胶囊与失眠PPI网络涉及8味中药，35个活性成分，120个交集靶点和1个疾病，分别用红色圆形、绿色菱形、蓝色三角形和黄色正方形表示。见图7。获得的18个活性成分可能是舒眠胶囊治疗失眠的主要活性成分，选取Degree值前8位的主要活性成分作为舒眠胶囊的关键活性成分进行分子对接。见表3。

　　2.8分子对接模拟验证

　　所有对接的最低结合能结果均小于0，说明配体与受体均可自发结合，其中PIK3R1蛋白与9个小分子结合的最低结合能均小于-5 kJ/mol，结合效果整体要优于其他4种，而CXCL8蛋白结合效果较差。A3(山柰酚)、DXC4(灯心草菲类衍生物)与5位靶点基因的结合能均小于阳性药物，A4(槲皮素)、DXC2(木犀草素)、DXC11与4位靶点基因的结合能均小于阳性药物，A4、A3、DXC2、DXC11及DXC4可能是舒眠胶囊治疗失眠的关键成分。见图8。

　　PIK3R1与DXC4在Val851形成氢键，且作用距离为3.18 ;TNF与A3在Tyr151形成氢键，且作用距离为2.67 ;CXCL8与DXC5无氢键作用，这可能是结合力不高的原因;AKT1与A4在Ala123、Glu234和Asp292形成氢键，且作用距离为3.01 、2.66 和2.70 ;IL6与A4在Glu672、Met704和Asp784形成4个氢键，且作用距离为3.01 、2.64 、2.97 和2.98 ;PIK3R1与Zolpidem在Gln859形成氢键，且作用距离为3.22 。见图9～14(A：小分子-蛋白对接，B、C：小分子与蛋白对接细节)。

　　3讨论

　　舒眠胶囊治疗失眠疗效确切，多项随机对照试验结果显示，舒眠胶囊对比阳性药物，在失眠治疗中有效率更高[9]。中医将失眠称为不寐，多因肝郁化火伤阴，动摇心神，神不安而不寐。本方可用于肝郁伤神所致的失眠症，其中酸枣仁和柴胡以其宁心安神、疏肝解郁的功效共为君药;白芍、合欢皮、合欢花3药为臣，养血柔肝、解郁安神;僵蚕归肝、肺、胃经，息风止痉、化痰散结，蝉蜕归肺、肝经，散风除热、疏肝解痉，二药共调肝脏，祛痰熄风，为佐药;灯心草性寒，既可清心火，又可利小便以引导心火下降，为使药。诸药配合可达疏肝解郁、宁心安神之效。

　　酸枣仁为养心安神之要药，有效成分包括酸枣仁总皂苷、总黄酮、总生物碱等化合物，已被证实具有催眠、镇静作用。Yan等[10]酸枣仁水提物联合戊巴比妥钠喂给失眠模型小鼠，结果显示，小鼠睡眠潜伏期显著缩短，睡眠时间明显增加，其催眠作用可能与单胺类神经递质水平增加、神经递质合成中的氨基酸代谢改变相关。柴胡是伞形科植物柴胡的干燥根，具有疏肝解郁的功效，研究显示，柴胡中的柴胡皂苷通过促进脑脊液中5-羥色胺的分泌改善失眠[11]。2021年西安交通大学医学部的一项实验中，梁凡凡等[12]将舒眠胶囊分别喂给戊巴比妥钠给药小鼠和PCPA失眠大鼠，结果显示，舒眠胶囊具有镇静、催眠的作用，其具体作用机制与提高脑组织伽马氨基丁酸水平、降低葡萄糖水平、上调海马5-羟色胺1a受体蛋白的表达相关。

　　3.1舒眠胶囊富集分析

　　根据GO富集与KEGG通路富集结果，舒眠胶囊通过多个途径起治疗作用。排除癌症等通路后，结合失眠的发病过程与常见信号通路，舒眠胶囊可能通过以下3条炎症介质相关通路发挥作用。

　　Toll样受体(TLRs)信号通路是一个受体家族，参与病原体识别和宿主防御，其上游为内源性(损伤相关分子模式，DAMPs)或外源性(病原体相关分子模式，PAMPs)配体[13]。TLRs中的TLR4通路已被证明可以触发和调节神经炎症反应[14]。研究表明，睡眠剥夺增强了TLR4和其下游MyD88的过表达，MyD88通过触发核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)的表达，上调促炎症基因的表达[15]。875E204C-D465-43B7-946D-FEFA86E0F319

　　TNF是免疫系统重要的细胞因子，TNF信号通路的激活与细胞凋亡、细胞成活、炎症和免疫等生物过程相关[16]。当TNF含量正常时，TNF通过节律性表达调控睡眠觉醒节律，延迟非快速眼动睡眠的觉醒时间，当TNF含量过高时，也发挥抑制正常睡眠的作用[17]，因此推测TNF信号通路与睡眠关系密切。

　　PI3K/AKT信号通路的下游基因为IL-6、TNF等炎症介质基因，该信号通路的表达上调炎症基因转录活性，促使血清中炎症介质增加[18]。研究表明，快速眼动睡眠小鼠睡眠剥夺后可引起氧化应激和炎症反应，剥夺睡眠7 d后，小鼠脑组织中的小胶质细胞和星形胶质细胞激活，下游PI3K/AKT/sk-3β的激活降低，炎症介质水平增加，抗炎因子、转录因子Nrf-2和抗氧化剂酶HO-1的水平降低[19]。还有研究表明，ApoM-S1P可通过与S1PR2结合激活PI3K/AKT通路，增加PI3K和AKT磷酸化，减轻TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)损伤和炎症反应，阻止核因子κB的核转运，降低凋亡相关蛋白、炎症介质和黏附分子的表达[20-21]。

　　基于此，本研究推测舒眠胶囊可通过多个信号通路发挥治疗失眠的功效，分子对接结果显示，与关键有效成分对接良好的PIK3R1、TNF、AKT1、IL6均与炎症通路相关，Toll样受体信号通路、TNF信号、PI3K/AKT通路可能是舒眠胶囊治疗失眠的关键机制之一。

　　3.2关键靶点的分析

　　通过SPRING分析得到舒眠胶囊的核心靶点有14位，其中，PIK3R1、TNF、CXCL8、AKT1、IL6等涉及炎症反应相关的靶点节度值最高，分子对接结果表明这些靶点与关键活性成分有较好的结合力，说明舒眠胶囊可通过这些重要靶点发挥治疗作用。PIK3R1基因是PI3K调节亚基的编码基因，PI3K是细胞内重要的信号转导分子，参与介导炎症、应激等细胞反应[22]。蛋白激酶B AKT1调控神经细胞凋亡[23]，参与调节代谢、增殖、生长和血管的生成等过程[24]。CXCL8基因表达IL-8，IL-8属于细胞因子的一种，可影响炎症刺激。大量研究证明，睡眠障碍与IL-1β、IL-6、TNF等炎症介质密切相关，炎症介质通过调控睡眠觉醒周期、影响慢波睡眠而诱导失眠[25-26]。

　　总之，舒眠胶囊可能通过调节上述基因的表达，调控炎症介质水平，介导炎症反应，达到改善失眠症状的目的。

　　3.3舒眠胶囊的成分分析

　　槲皮素、山柰酚和木犀草素均为黄酮类化合物，实验表明，黄酮类化合物可通过消除自由基、抗氧化作用而抑制炎症、调节免疫[27]。槲皮素是自然界分布最广的类黄酮化合物，具有抗炎、降低细胞毒性、增加5-羟色胺水平、抑制神经递质伽马氨基丁酸传递等作用[28]。木犀草素是灯心草经乙酸乙酯提取后含量最大的成分，已知对各种神经疾病如癫痫和阿尔茨海默病有神经保护作用，实验表明木犀草素激活A1R、A2AR靶点表达，增加小鼠非快速眼动睡眠时间而改善失眠[29]。山柰酚可消除自由基、抗氧化、抑制神经元凋亡并促进神经再生[30]，也有研究表明山柰酚通过抑制核因子κB通路的激活，达到抑制神经炎症及保护血脑屏障功能而改善大鼠脑缺血再灌注神经功能[31]。β-谷甾醇是一种常见的植物甾醇，可增加5-羟色胺和去甲肾上腺素等神经递质水平改善失眠，还可减少NO的合成，抑制巨噬细胞IL-6活性，减少IL-1、TNF等炎症介质的分泌，经抗炎作用改善失眠[32]。另外，DXC12、DXC11、DXC5、DXC4均为灯心草菲类衍生物，有实验表明，灯心草菲类衍生物具有一定抗焦虑及镇静作用[33]，亦有研究表明DXC5即9，10-二氢类菲可影响小鼠DA及5-羟色胺的代谢，起到抗焦慮活性的作用[34]。

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