中华鳖暗温室养殖水体理化因子及微生物多样性分析

　　摘 要：暗温室是中华鳖(Pelodiscus sinensis)人工养殖的主要方式之一。为阐明中华鳖暗温室养殖过程中高氮水体和低氮水体中微生物多样性及其与环境因子的关系，在河北省鹿泉中华鳖暗温室养殖池挑选了总氮浓度较高的池塘和总氮浓度较低的池塘进行了水体理化因子监测和微生物多样性对比分析。水体理化因子检测结果显示两种水体的温度均在30 ℃左右，pH值为7左右，符合中华鳖的养殖要求。两种水体的溶解氧为0.25 mg/L左右。高氮水体的总氮、氨氮、亚硝态氮、硝态氮的浓度相较于低氮水体均比较高。高氮与低氮水体在各分类水平上的优势菌群均存在差异，低氮水体绿屈扰菌门(Chloroflexi)占据主要优势，而高氮水体中变形菌门(Proteobacteria)占主要优势，属水平层次上低氮水体中的优势菌为束缚杆菌属(Haliscomenobacter)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)。高氮水体多核杆菌属(Polynucleobacter)、亮杆菌属(Leucobacter)占据优势地位，两种水体物种丰富度及相似度存在差异。结果表明高氮与低氮水体不仅在总氮和无机氮浓度上差别较大，微生物多样性也存在明显差距，微生物区系不同可能是造成氮浓度差异的原因之一。

　　关键词：中华鳖(Pelodiscus sinensis);微生物多样性;暗温室养殖;理化因子;环境调控

　　中华鳖口感鲜美，含有丰富的蛋白质、维生素以及微量元素，是一种高蛋白低脂肪的食物原料，长期以来一直被视为珍品，市场需求高涨[1]。中华鳖现有养殖模式主要有日光棚集约化养殖、暗温室高密度养殖、日光棚+暗温室两段式养殖、仿生态养殖等[2]。高密度的暗温室养殖养殖密度大、产量高，优点是光线较弱，中华鳖互相撕咬现象明显减少，缺点是水体中残饵和粪便积累，养殖水体污染严重，患病几率增加。本实验通过对河北省鹿泉中华鳖暗温室高氮和低氮养殖水体进行水质理化参数监测和微生物多样性分析，阐明水体环境参数和微生物区系组成，为改善养殖水体水质特别是减少氮源污染，实现中华鳖健康养殖提供参考依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 样品采集

　　分别取中华鳖良种场暗温室两个池塘养殖水体样品，总氮浓度较高的养殖池塘，记为H-N，总氮浓度较低的养殖池塘，记为L-N。分别在两个池塘的左、中、右位置取水，每个池塘取3个水样，用于水质监测和微生物多样性分析。

　　1.2 水体理化因子分析

　　现场采样过程中，采用YSI pH100A便携式酸度计测定pH值，采用YSI DO200便携式溶氧仪测定溶解氧浓度。水样带回实验室测定总氮、氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮等化学指标。总氮采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法进行测定，氨氮采用纳氏试剂-分光光度法进行测定，亚硝酸盐采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法进行测定，硝酸盐采用紫外分光光度法进行测定[3]。

　　1.3 水体微生物多样性分析

　　1.3.1 样品处理 过滤前静置分离悬浮颗粒，用20 μm大孔径滤膜预过滤一遍，再用0.22 μm微孔滤膜进行抽滤，水样过滤之后，将微生物富集的滤膜装在50 mL离心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

　　1.3.2 DNA提取、PCR和高通量测序 水体微生物多样性由上海派森诺生物科技股份有限公司进行测定。提取总DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度计对DNA进行浓度和质量检测，设计简并引物：520F：5’-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3’， 802R： 5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’扩增细菌16S rRNA V4区 (C，T = Y; G，A，T = D; A，C，G = V; A，C，G，T =N) 。PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并进行磁珠纯化回收。回收产物采用酶标仪Microplate reader(BioTek，FLx800)测定浓度，所用试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據测定的浓度，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，最后上机进行高通量测序。

　　1.3.3 测序数据的筛查与处理 运用QIIME 2软件切除序列的引物片段，弃去未匹配引物的序列。随后，通过QIIME 2软件调用DADA2进行质控、去噪、拼接、去嵌合体序列获取高质量的数据。

　　1.3.4 物种分类学注释 对于细菌或古菌的16S rRNA基因，默认选用Greengenes数据库。对于每个ASVs的特征序列或每个OTU的代表序列，在QIIME2软件中使用默认参数，使用预先训练好的Naive Bayes分类器进物种注释。

　　1.3.5 α-多样性分析 多样性是指局部均匀生境下的物种在丰富度(richness)、多样性(diversity)和均匀度(evenness)等方面的指标[4]，也被称为生境内多样性，反映的是单个样品中的物种多样性。采用香农-威纳多样性指数(Shannon-Wiener diversity index)、辛普森多样性指数(Simpson diversity index)、Chao1指数、Pielou均匀度指数(Pielou evenness index)和覆盖率(Coverage)对6个样品中微生物的α-多样性进行比较和分析[5]。样品中的群落多样性用香农-威纳多样性指数[6]和辛普森指数估算，样品中的物种总数(OTU数目的指数)用Chao1[7]算法估计，样品中群落的均匀度用Pielou均匀度指数估算，用样品文库的覆盖率[8]评价测序结果的真实性。

　　1.3.5 物种差异分析及标志物种 为了探究微生物群落组成上的差异(即β-多样性)，了解微生物群的差异主要是由哪些物种的差异分布所导致的，借助ASV/OTU维恩图、物种组成热图、LEfSe分析等方法来进行分析，进一步展示样品间的物种差异。

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