加味丹参饮作用内源性H2S合成途径保护心肌缺血/再灌注损伤的实验研究

　　〔摘要〕 目的 通過观察益气活血中药组方加味丹参饮(JWDS)对心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)模型大鼠血清硫化氢(H2S)合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， DH)含量、心肌组织超微结构、心肌组织CSE mRNA表达的影响，从内源性H2S合成途径探讨JWDS治疗MIRI的作用机制。方法 给药组大鼠按剂量6.19 g/(kg·d)要求给药14 d，末次给药2 h后采用结扎冠脉左前降支/再灌流方法复制MIRI模型。HE染色观察心肌组织机构改变情况;ELISA法检测血清CK、LDH、CSE含量;Western-blot检测心肌组织CSE蛋白表达;Real-time PCR检测心肌组织CSE mRNA表达。结果 JWDS可明显改善MIRI模型大鼠心肌组织病理改变，降低血清LDH、CK含量(P<0.01)，升高CSE含量(P<0.01)，上调心肌组织CSE及mRNA表达(P<0.05，P<0.01)。PPG可明显降低JWDS组大鼠血清CSE含量(P<0.01)，下调心肌CSE mRNA表达(P<0.01)。结论 JWDS对实验性心肌缺血/再灌注(MIR)大鼠心肌损伤具有明显保护作用，其机制与促进内源性H2S生成从而保护心肌细胞结构，抑制CK、LDH漏出，上调心肌组织CSE蛋白及mRNA表达有关。

　　〔关键词〕 心肌缺血再灌注;加味丹参饮;益气活血; H2S;CSE

　　心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)是指心肌缺血后冠状动脉再通，恢复供血后导致的复杂心肌损伤反应，是导致溶栓治疗、心脏移植及冠脉搭桥等治疗手段失败的主要原因[1-4]。MIRI可导致包括再灌注性心律失常、心肌顿抑、血液无复流、微血管内皮细胞损伤以及微循环障碍等在内的一系列功能、结构、代谢方面的损伤，临床治疗心血管疾病应尽量避免MIRI带来的负面作用，對MIRI的临床表现、发病机制以及防治途径的研究具有重要意义[5-6]。硫化氢(H2S)是一种类似于一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)的内源性气体信号分子，主要由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)催化底物L-半胱氨酸生成[7]。研究发现H2S可自由穿过细胞膜，是细胞防御的内源性机制，外源性H2S干预对离体心脏缺血预处理具有明显的保护作用[8]。

　　加味丹参饮(JWDS)是跟据大量临床经验，从《时方歌括》丹参饮化裁而来，由黄芪、丹参、檀香、川芎、赤芍等组成，全方共奏益气活血之功，在临床上对防治冠心病心绞痛有很好的疗效。部分研究证实该方可通过调控细胞凋亡、抗炎等有效途径的减轻心肌缺血再灌注损伤。但其多环节、多靶点作用的确切机制还未完全阐明。为探究是否通过内源性H2S调节通路对MIRI发挥治疗作用，本实验通过观察加味丹参饮JWDS对MIRI模型大鼠心肌组织细胞形态、血清合成酶/胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyse， CSE)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes， CK)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， DH)含量、心肌组织CSE及mRNA表达的影响，以及H2S合成酶抑制剂PPG对JWDS治疗效果的影响，进一步阐释JWDS保护MIRI的作用机制。

　　1 材料

　　1.1 动物

　　SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证编号：SCXK(湘)2014-0008。

　　1.2 主要药物与试剂

　　加味丹参饮(由丹参、檀香、赤芍、川芎、当归、红花、生地黄、黄芪等组成)，湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供;LDH、CK、CSE ELISA试剂盒均购于武汉基因美生物，批号201804;硫氢化钠(NaHS)，美国Sigma公司;RIPA(强)组织细胞快速裂解液(批号PAB180006)、Goat-anti-rabbit IgG二抗(批号PAB150011)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号PAB180007)均购于BIOSWAMP公司;Anti-rabbit CSE抗体(批号Ab80643)、Anti-rabbit抗β-Actin抗体(批号Ab8227)均购于美国Abcam公司;Trizol试剂(批号15596026)，ambion公司;YBR Green PCR试剂盒(批号KM4101)，KAPA Biosystems公司;逆转录试剂盒(批号639505)，TAKARA公司。

　　1.3 仪器

　　小动物呼吸机(DW-3000，淮北正华生物仪器设备有限公司);FX-211小动物心电图机(北京福田电子医疗仪器有限公司);MK3型酶标仪(芬兰雷勃);AC8型自动洗板机(Thermo公司);TG16W型微量高速离心机(湖南湘仪);GNP-9080型隔水式恒温培养箱(上海精宏);mini protean 3 cell型电泳仪、Real-time PCR、Universal Hood Ⅱ型凝胶成像系统(美国BIO-RAD);K30型干式恒温器(杭州爽盛仪器);Centriguge 5424 R型离心机(德国Eppendorf);Tanon-5200型ECL分析仪(上海天能)。

　　2 实验方法

　　2.1 分组与给药

　　取SD大鼠70只，按体质量随机分为空白组、假手术组、MIRI模型组(MIRI组)、缺血预适应组(IP组)、NaHS+MIRI组(NaHS组)、加味丹参饮+MIRI组(JWDS组)、加味丹参饮+PPG+MIRI组(JWDS+PPG组)，每组10只。JWDS组与JWDS+PPG组每日以加味丹参饮(6.19 g/kg)灌胃，JWDS+PPG组于再灌注前30 min以CSE合成酶抑制剂PPG(33.9 mg/kg)腹腔注射干预，NaHS组以28 μmol/kg NaHS腹腔注射，空白组、假手术组、MIRI、IP组以等量生理盐水灌胃，给药体积均为10 mL/kg。每日给药1次，连续14 d。

　　2.2 缺血再灌注模型建立

　　末次给药2 h后建立MIRI模型。除空白组外，各组大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于解剖台上，颈部备皮消毒。切开气管，以8号灌胃针进行气管插管，动物呼吸机(呼吸频率60～80次/min，潮气量5～7 mL)辅助呼吸。沿第3/4肋骨上缘打开胸腔暴露心脏，剪开心包，沿冠状动脉于左前降支下方约2 mm处用无创缝合线结扎冠状动脉，连续监视心电图的变化，出现ST段弓背抬高，T波高耸/倒置或左心室变为苍白色即确认阻断成功。30 min后放松结扎线，再灌注90 min以ST 段回落1/2以上，T波下降或左心室由苍白变为暗红色表示再灌注成功。假手术组仅做开胸处理，不结扎。

　　2.3 HE染色观察心肌组织病理变化

　　取大鼠心肌组织，10%多聚甲醛浸泡固定，石蜡包埋，间断连续切片，HE染色，正置显微镜下观察心肌组织病理变化并拍照。

　　2.4 ELISA检测大鼠血清CSE、CK、LDH含量

　　大鼠心肌缺血/再灌注24 h后，脱颈处死大鼠，腹主动脉取血，室温静置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清，分装后置于-20 ℃冰箱冻存备用。参照ELISA试剂盒说明，检测血清CSE、CK、LDH含量。

　　2.5 Western blot检测心肌组织CSE表达

　　取大鼠左心室心肌组织，加入预冷RIPA裂解液研磨，提取总蛋白，测定蛋白含量。制备好的蛋白样品，经12%SDS-PAGE凝胶电泳后，电转至PVDF膜，转膜后置于含5%脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，Anti-rabbit CSE/β-actin一抗(CSE 1∶1 000稀釋;β-Actin1∶10 000稀释)4 ℃下孵育过夜。加HRP标记的Goat-anti-rabbit IgG二抗(1∶10 000稀释)室温孵育1 h后，加入ECL发光液显影，ECL分析系统检测并拍照，Image J软件计算条带吸光度值。

　　2.6 Real-time PCR检测心肌组织CSE mRNA表达

　　再灌注结束后取大鼠左心室组织，Trizol试剂冰上提取总RNA后，测定样品RNA纯度及浓度。以总RNA为模板，按反转录试剂盒合成cDNA，进行扩增。引物序列：CSE-F：CCACCACAACGATTACCC;CSE-R：AGTCCAAACTCGGATGCC，引物长度：112 bp;β-Actin-F：CGTTGACATCCGTAAAGAC;β-Actin-R：TAGGAGCCAGGGCAGTA，引物长度：110 bp。PCR扩增条件为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 5 s，56 ℃10 s，72 ℃ 25 s循环 40 次。以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算CSE mRNA相对表达量。

　　2.7 统计学处理

　　所有数据以Excel表格进行统计，Graphpad prism 7软件进行分析。结果以“x±s”表示，组间比较以one-way ANOVA单因素方差分析及q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 JWDS对MIRI模型大鼠心肌组织超微结构的影响

　　与空白组比较，模型组大鼠心肌组织局部坏死，细胞结构模糊，边界不清，胞内水肿明显，心肌细胞走形紊乱。与模型组比较，JWDS组大鼠心肌组织超微结构明显改善，细胞走形规律，轮廓完整，水肿程度减轻，JWDS+PPG组大鼠心肌组织坏死程度加重，细胞结构破坏，炎性细胞浸润增多。见图1。

　　3.2 JWDS对MIRI模型大鼠血清CSE、CK、LDH含量的影响

　　与空白组比较，模型组大鼠血清LDH、CK含量明显升高(P<0.01)，CSE含量明显降低(P<0.01)。与模型组比较，JWDS组LDH、CK含量明显降低(P<0.01)，CSE含量明显升高(P<0.01)。与JWDS组比较，JWDS+PPG组CSE含量明显降低(P<0.01)。

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文章名称： 加味丹参饮作用内源性H2S合成途径保护心肌缺血/再灌注损伤的实验研究

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