小反刍兽疫病毒间接化学发光抗体检测方法的建立与优化

　　摘要：构建了原核表达质粒pET-28a-N，经原核表达纯化获得小反刍兽疫病毒N蛋白。将纯化的小反刍兽疫病毒N蛋白与对应的酶标二抗配对，通过对各个反应条件的优化建立了间接化学发光抗体检测方法。通过对血清样本的检测，对该方法的敏感性、特异性、重复性、符合率进行了评价。试验结果显示：N蛋白最适包被浓度为0.5 μg/mL，最适包被条件为4℃ 24 h;酶标二抗最适工作浓度为1∶2000。特异性试验证明，该方法与羊常见病毒的抗体阳性血清没有交叉反应。通过检测大量小反刍兽疫病毒抗体阴、阳型血清，确定了科学的判定标准。

　　关键词：原核表达;最适条件;临界值

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　　小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一种反刍动物的烈性病毒性疾病。小反刍兽疫病毒具有高度传染性，绵羊和山羊为主要感染动物，偶尔感染野生小反刍动物，例如岩羊、野山羊等[1]。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。在《2018年国家动物疫病强制免疫计划》规定对全国所有羊进行小反刍兽疫免疫。本试验利用原核表达的小反刍兽疫N蛋白作为包被抗原与其酶标二抗配对，构建了间接化学发光抗体检测方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要试剂

　　pET-28a原核表达载体、BL21感受态细胞由本公司实验室保存;法国ID-VET《小反刍兽疫抗体检测试剂盒》购于上海拜力生物科技有限公司;小反刍兽疫活疫苗(Clone9株)购于新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。

　　1.1.2 血清样本

　　小反刍兽疫阳性血清、小反刍兽疫阴性血清购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心。500份已知来源的临床羊血清由洛阳莱普生信息科技有限公司提供，并经法国ID-VET小反刍兽疫病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒检验证明。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小反刍兽疫N蛋白的表达

　　小反刍兽疫病毒是单股负链RNA病毒，编码8种已知蛋白，其中6种为结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、大蛋白(L)、血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)。大多数血清学检测技术是针对小反刍兽疫病毒的核衣壳蛋白和血凝素蛋白而建立的[2]。大多数的单链RNA病毒，包括小反刍兽疫病毒在内，N蛋白高度保守，免疫原性也较高。由于接近病毒基因组的3'末端，N蛋白的含量比其他结构蛋白都要高。虽然针对N蛋白的抗体不能保护动物免受该病侵害，但由于抗原性较好而且含量丰富，N蛋白仍然是小反刍兽疫诊断工具最易接受的目标[3]。

　　从gene bank上查找小反刍兽疫N蛋白的基因序列号为AJ563705.1，并设计引物。上游引物序列为：5'-AATAGGATCCGCG CACGTGAACGACATGCTGA -3'，下游引物序列为：5'-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG-3'。使用RNA提取试剂盒从小反刍兽疫疫苗中提取病毒核酸。并通过反转录PCR获得cDNA，使用上述一对引物扩增出小反刍兽疫N蛋白主要抗原表位区基因。将扩增出来的目的基因、pET-28a空载体分别经双酶切之后与pET-28a载体连接。将重组质粒转化BL21大肠杆菌感受态细胞。经过条件筛选，确定合适的IPTG诱导浓度，培养温度。经表达纯化获得的小反刍兽疫N蛋白可作为试剂盒生产中的包被抗原使用。

　　1.2.2 包被缓冲液的选择

　　分别选取25mM PBS(pH值7.4)、碳酸盐缓冲液(pH值9.6)、50mM Tris-HCl(pH值8.0)作为包被缓冲液，包被浓度均为1 μg/mL。每孔100 μL，2～8℃放置24 h。用PBST洗板2次，每孔加入1.5% BSA，2～8℃封闭24 h。阳性对照血清1/20稀释之后加入到化学发光反应板中，每孔加入100 μL，最后一行作为无血清对照。37℃反应1 h，PBST洗涤5次，吸水纸上拍干之后，每孔加入100 μL工作浓度的羊抗猪酶标二抗。37℃反应1 h，PBST洗涤5次，吸水纸上拍干之后，每孔加入化学发光底物A液50 μL、化学发光底物B液50 μL。室温、避光反应5 min，使用化学发光免疫分析仪读数。

　　1.2.3 包被条件的摸索

　　分别选取37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三种包被条件进行摸索。以1 μg/mL的蛋白浓度进行包被，每孔加入100 μL。使用1.5% BSA封闭，阳性对照血清1/20稀释之后加入化学发光反应板进行反应。选择化学发光值高，并且變异系数最小的条件进行包被。

　　1.2.4 封闭缓冲液的选择

　　分别选取 1.5% BSA、1%酪蛋白、10%马血清、3%明胶作为封闭液。封闭条件为2～8℃24 h。在化学发光反应板上测定阳性对照血清、阴性对照血清，计算二者化学发光值的比值(P/N)，根据比值大小确定最适封闭液。

　　1.2.5 血清稀释倍数和抗原包被浓度的确定

　　使用棋盘滴定法来筛选最佳条件。使用包被缓冲液在化学发光包被板上按照浓度梯度进行包被。选取阳性对照血清、阴性对照血清进行梯度稀释，进行测定。实验布局如表1所示。根据最终读取的化学发光值计算阳性对照血清、阴性对照血清二者的比值(P/N)，比值最大时为最适抗原包被浓度与血清稀释倍数。

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文章名称： 小反刍兽疫病毒间接化学发光抗体检测方法的建立与优化

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