胆囊良恶性病变组织中蛋白基因产物9.5的表达及临床意义

　　【摘要】 目的 研究胆囊腺癌、癌旁组织、慢性胆囊炎组织中蛋白基因产物9.5(PGP9.5)表达及其临床病理意义。方法 108例胆囊腺癌、46例癌旁组织和35例慢性胆囊炎切除标本常规石蜡包埋切片，PGP9.5染色方法为EnVisionTM免疫组化法。结果 胆囊腺癌PGP9.5表达阳性率(45.4%)和评分(1.94±1.84)明显高于癌旁组织(17.4%，X2=10.83，P<0.01;0.86±1.41，t=3.60，P<0.01)和慢性胆囊炎组织(11.4%，X2=13.06，P<0.01;0.58±1.29，t=4.08，P<0.01);PGP9.5阳性良性病变胆囊上皮均呈中至重度不典型增生。患者年龄≤45岁、腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径<2 cm、无淋巴结转移和未侵犯周围组织病例PGP9.5表达阳性率及其评分明显低于年龄>45岁、低分化腺癌、肿块最大径≥2 cm、淋巴结转移和侵犯周围组织病例(P<0.05或P<0.01)。结论 PGP9.5表达可能是反映胆囊腺癌发生、进展和预后的重要生物学标志物，检测胆囊良性病例PGP9.5表达水平对于预防和早期发现胆囊癌可能有重要临床意义。

　　【关键词】 胆囊肿瘤 慢性胆囊炎 蛋白基因产物9.5 免疫组织化学

　　Abstract Objective To study the expression of PGP9.5 and its clinicopathological significances in tissues of gallbladder adenocarcinoma， pericancerous tissues and chronic cholecystitis. Methods Immunohistochemical method was used for the detection of PGP9.5 expressive levels in routinely paraffin-embedded sections from the specimens of gallbladder adenocarcinoma (n=108)， pericancerous tissues (n=46) and chronic cholecystitis (n=35). Results The positive rates and scores of PGP9.5 in gallbladder adenocacrcinoma (45.4%， 1.94±1.84) were significantly higher than those in pericancerous tissues (17.4%， X2=10.83， P<0.01; 0.86±1.41， t=3.60， P<0.01) and chronic cholecysitis (11.4%， X2=13.06， P<0.01; 0.58±1.29， t=4.08， P<0.01). The positive rates and scores of PGP9.5 were significantly lower in the cases of aged ≤45 years， adenomatous canceration or high-differentiatied adenocarcinoma， maximal diameter of mass <2 cm， no-metastasis of lymphnode， and no-invasion of regional tissues than those in the ones of aged >45 years， low-differentiated adenocarcinoma， maximal diameter of mass ≥2 cm， metastasis of lymphnode and invasion of regional tissues. Conclusion The expressive levels of PGP9.5 may be an important marker for reflecting the carcinogenesis， progression， biological behaviors and prognosis of gallbladder adenocarcinoma. The assayes of PGP9.5 expressive levels in benign lesions of gallbladder may have important clinical values for the prevention and early-stage finding of gallbladder carcinoma.

　　Key words gallbladder neoplasms; chronic cholecystitis; protein gene product 9.5; immunohistochemistry 蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5， PGP9.5)是一种分子量为27KD的神经元特异性蛋白质，为神经内分泌肿瘤的标志物。但新近发现PGP9.5不仅在神经内分泌肿瘤细胞表达，也可在其他上皮源性肿瘤细胞中表达，且其表达水平与上皮源性恶性肿瘤发生、进展及预后有密切关系[1-6]。国内外尚未见胆囊良恶性病变组织中PGP9.5表达研究的文献报道。我们应用EnVisionTM免疫组化方法研究胆囊腺癌、癌旁组织和慢性胆囊炎组织中PGP9.5表达水平及其临床病理意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本及临床病理资料 收集湘雅二医院、湘雅医院和湖南省人民医院1996年6月至2006年6月间胆囊癌手术切除标本108例，男性31例(28.7%)，女性77例(71.3%)。病理类型均为腺癌，其中腺瘤癌变9例(8.2%)，高分化腺癌29例(26.9%)，中分化腺癌29例(26.9%)，低分化腺癌30例(27.8%)，黏液腺癌11例(10.2%);术中发现侵犯胆囊外周围组织器官59例(54.6%);共有59例发生区域淋巴结转移(54.6%);58例伴有胆囊结石(53.7%);手术方式包括根治性切除34例(31.5%)，姑息手术48例(44.4%)和因广泛转移不能手术仅取转移灶癌组织26例(24.1%)。从以上108例胆囊腺癌中选择46例癌旁组织(距癌组织≥3 mm)，其中正常10例、轻度不典型增生10例，中度不典型增生12例和重度不典型增生14例。另收集35例慢性胆囊炎组织标本(单纯慢性胆囊炎15例、慢性胆囊炎伴胆囊结石20例)作为对照，其中正常胆囊黏膜11例、轻度不典型增生12例、中度不典型增生7例及重度不典型增生5例。以上标本经4%甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片，切片厚4 ?滋m。

　　1.2 主要试剂 　兔抗人PGP9.5多克隆抗体购自北京金桥中杉生物技术公司， EnVisionTM探查试剂盒(兔/鼠)购自上海基因技术有限公司。

　　1.3 方法 　PGP9.5染色方法为EnvisionTM二步免疫组化法，主要步骤：切片脱蜡至水洗→3% H2O2甲醇液15 min→流水冲洗，0.125% EDTA抗原修复液15 min→流水冲洗，蒸馏水洗→滴加兔抗人PGP9.5多克隆抗体(1/100) 37℃ 60 min→0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗3次×5 min→滴加A液37℃ 30 min→0.01 mol/L PBS液洗3次×5 min→滴加DAB显色液15 min→流水冲洗→苏木素液 1 min→流水返兰15 min→脱水，透明、中性树胶封固。细胞浆内含棕黄色颗粒者为阳性细胞，评分标准：将切片中细胞浆着色强度评分(无，0分;弱， 1分;中，2分;强，3分)和切片中阳性细胞率评分(≤5%，0分;6%～10%，1分;11%～20%，2分;21%～50%，3分;>50%，4分)之和为该切片评分值，将评分值≤2分定为阴性病例，≥3分定为阳性病例。以北京金桥中杉生物技术公司提供的阳性切片作为阳性对照，以0.01 mol/L PBS液(pH7.4)替代一抗作为阴性对照。统计学方法：将所得数据输入至 SPSS 13.0统计软件中进行t检验、F检验或Fishers精确概率法，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 PGP9.5在胆囊良恶性病变中表达情况 PGP9.5免疫组化反应阳性产物定位于胞浆(见图1，2)。108例胆囊腺癌PGP9.5表达阳性病例49例(45.4%)，其评分均值为1.94±1.84;46例癌旁组织PGP9.5阳性8例(17.4%)，其评分均值为0.86±1.41;35例慢性胆囊炎PGP9.5阳性病例为4例(11.4%)，其评分均值为0.58±1.29;PGP9.5表达阳性的癌旁组织和慢性胆囊炎病例胆囊黏膜上皮均呈中至重度不典型增生。胆囊腺癌PGP9.5表达阳性率及其评分均值明显高于癌旁组织(X2=10.83，P<0.01;t=3.60，P<0.01)和慢性胆囊炎组织(X2=13.06，P<0.01;t=4.08，P<0.01)。

　　2.2 PGP9.5表达与胆囊腺癌临床病理特征的关系

　　腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径<2 cm、无淋巴结转移及未侵犯周围组织病例PGP9.5表达阳性率及其评分明显低于低分化腺癌、肿块最大径≥2 cm、淋巴结转移及侵犯周围组织病例(P<0.05或P<0.01)。见表1。

　　3 讨论

　　PGP9.5是一个泛素水解酶，它广泛表达于神经元分化的各个阶段，为神经内分泌系统的一个特定组织标志物。当前积累的资料显示泛素羧基末端羟化酶家族在细胞的蛋白水解途径中起调节细胞周期和死亡的重要作用，蛋白去泛素化与细胞周期调节及恶性肿瘤发生发展的关系近年来日渐引起关注。PGP9.5介导的针对细胞蛋白的泛素——蛋白酶体系统，可能是调节细胞周期基因的重要机制，通过引起细胞周期蛋白的去泛素化增加促进未分化的体细胞无序生长和繁殖，同时PGP9.5的表达可能诱导一些能影响细胞分裂周期的基因[1-6]。因此PGP9.5在调节细胞周期蛋白表达方面具有重要作用，从而与恶性肿瘤发生发展及预后有重要关系。Hibi等[1]发现PGP9.5表达不仅与小细胞肺癌发生、进展及预后有关，而且也与非小细胞肺癌发生、进展及预后有密切关系，高表达者进展快、易发生转移、侵袭潜力强及预后差，认为PGP9.5的表达是不依赖神经分泌而独立存在的和肺癌病理分期及预后相关的重要生物学指标。此后，国外学者相继研究了胃癌、食管癌、肠癌和甲状腺髓样癌PGP9.5表达及甲基化水平，均发现部分恶性肿瘤PGP9.5高表达，其表达水平及甲基化水平与恶性肿瘤发生、进展、转移、侵袭、临床病理分期及预后密切相关，高表达者及高甲基化水平者进展快、易发生转移、侵袭潜力强、临床病理分期高及预后差，而其相应来源的正常组织及良性病变组织PGP9.5呈低表达或不表达[2-6]。

　　本组资料显示，胆囊腺癌PGP9.5表达阳性率及其评分明显高于癌旁组织和慢性胆囊炎(P<0.01);PGP9.5阳性表达的癌旁组织和慢性胆囊炎胆囊上皮均呈中至重度不典型增生;腺瘤癌变或高分化腺癌、肿块最大径<2 cm，无淋巴结转移、未侵犯胆囊外周围组织病例PGP9.5表达阳性率及其评分明显低于低分化腺癌、肿块最大径≥2 cm、淋巴结转移及侵犯周围组织病例。其结果与国外学者在其他恶性肿瘤中的研究结果较一致，说明PGP9.5阳性的胆囊腺癌可能进展快、生长速率高，易发生淋巴结转移及侵犯周围组织器官，PGP9.5表达水平可能是评估胆囊腺癌进展、生物学行为和预后的重要生物学标志物，其作用机制可能与其调控细胞周期蛋白基因有关，但有待更深一步研究。

　　【参考文献】

　　[1] Hibi K， Westra WH， Borges M， et al. PGP9.5 as a candidate tumor marker for non-small-cell lung cancer[J]. Am J Pathol，1999，155(3)：711-715.

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　　[3] Mandelker DL， Yamashita K， Tokumaru Y， et al. PGP9.5 promoter methylation is an independent prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2005，65(11)：4963-4968.

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　　[6] Takase T， Hibi K， Yamazaki T， et al. PGP9.5 over expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Hepatogastroenterology，2003，50(53)：1278-1280.

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文章名称： 胆囊良恶性病变组织中蛋白基因产物9.5的表达及临床意义

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