妇科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的研究

　　〔摘要〕 目的 研究婦科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞体外增殖及免疫调节的影响。方法 分离制备小鼠脾淋巴细胞，将细胞分为空白组(不做任何处理)，刀豆蛋白A组(刀豆蛋白A干预，ConA组)，LPS组(脂多糖干预，LPS组)及不同浓度的妇科千金胶囊组(FKQ)，作用时间分别为24 h、48 h和72 h。CCK8法检测FKQ对小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响;MTT法检测ConA及LPS对脾淋巴细胞增殖的影响;流式细胞术检测各组小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例并计算CD4+/CD8+的比值;ELISA检测各组细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表达。结果 FKQ对小鼠脾淋巴细胞有显著的增殖作用，以浓度为30、40、50 μg/mL时其作用越明显(P<0.01);FKQ能对ConA诱导的T淋巴细胞及LPS诱导的B淋巴细胞增殖有着明显的促进作用，以浓度为50 μg/mL最显著(P<0.01);中、高浓度的FKQ协同ConA能升高CD4+的比例，降低CD8+的比例，显著升高CD4+/CD8+的比值(P<0.01)。此外，不同浓度的FKQ均能明显增加IFN-γ及IL-2的表达(P<0.01，P<0.05)，降低IL-4和IL-10的水平，以中、高浓度最为显著(P<0.01)，调节Th1/Th2平衡。结论 妇科千金胶囊可有效促进脾淋巴细胞增殖，升高CD4+和CD8+比例，促进Th1细胞因子的分泌，使Th1/Th2亚群向“Th1漂移”，调节Th1/Th2平衡，提高细胞免疫应答。

　　〔关键词〕 妇科千金胶囊;脾淋巴细胞;增殖;免疫调节;Th1/Th2

　　妇科千金胶囊(FKQ)是中国中药保护品种，收载于2015版《中华人民共和国药典》一部，由千斤拔、金樱根、穿心莲、单面针、功劳木、鸡血藤、当归、党参8味中药材组成，具有清热除湿、益气化瘀的功效。常用于湿热瘀阻所致的带下病、腹痛，症见带下量多、色黄质稠、臭秽、小腹疼痛、腰骶酸痛、神疲乏力等，既标本兼治，又扶正祛邪，临床上广泛用于妇科炎症，疗效甚佳。方中千斤拔祛风利湿解毒，金樱根清热利湿止带，二者同为君药;穿心莲和功劳木清热除湿，二者同为苦寒之品，合用使全方清热解毒之力增强;单面针以其辛温之性，可防穿心莲、功劳木过于苦寒而傷胃，使全方药性更趋平和，无伤正气之虞，三者共为臣药。当归补血活血、调经止痛，鸡血藤补血、活血、通络，二者合用既能补血调经，又能畅利血行而加强全方清热除湿、活血解毒之功能;党参补中益气、生津养血，与当归、鸡血藤合用气血双补、扶正固本，使全方融扶正、祛邪为一体，三者共为佐药。诸药合用使机体正气得以充养，邪气得以祛除，故诸症消除。

　　中医学十分重视人体的正气，强调正气是发病的主导，认为“正气存内，邪不可干;邪之所凑，其气必虚”。意指当人的正气在内，气血充足的时候，即机体免疫力正常，“外邪”即致病菌不容易侵犯机体致病;而当人体正气受损，即免疫功能低下时，致病菌容易乘虚而入发病。FKQ的治疗理念在清除致病菌的同时增强机体免疫力，后期通过强化自身免疫能力而防治疾病反复发作。脾脏作为机体最大的外周免疫器官，是T、B淋巴细胞的主要聚集场所，而T、B淋巴细胞作为机体免疫活性细胞，其激活、分化、增殖在免疫应答过程中起着重要的作用[1]。关于FKQ能调节由环磷酰胺引起的小鼠免疫功能障碍及FKQ组分中药对机体免疫调节研究较多[2-5]，但尚无FKQ对体外培养小鼠脾淋巴细胞的免疫增强活性的报道。因此，本实验以FKQ为研究对象，研究其对小鼠脾淋巴细胞的增殖及免疫调节的影响，以期为FKQ提高免疫作用机制的研究及开发利用奠定理论依据。

　　1 材料

　　1.1 实验动物

　　20只健康BALB/c雌性小鼠，体质量16～18 g，6～7周龄，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。实验动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，自由饮食饮水，实验程序由湖南中医药大学动物实验伦理委员会批准。

　　1.2 药品与试剂

　　妇科千金胶囊(FKQ)(产品批号20170231，株洲千金药业股份有限公司);CCK8(CA1210，北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(16000-044，美国gibco公司);1640培养基(C11875500BT，美国gibco公司);DMEM高糖培养基(SH30022.01，Hyclone公司);ConA刀豆蛋白、LPS脂多糖及MTT噻唑兰(批号分别为C8110、L8880、M8180，北京索莱宝科技有限公司);Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10 ELISA Kit(批号为PI508、PI575、PI612、PI522，上海碧云天生物技术有限公司)。

　　1.3 仪器

　　47103离心机(Eppendorf中国有限公司);SW-CJ-2FD苏州净化超净工作台(上海叶拓科技有限公司)、Blender 快速组织细胞破碎仪(美国 NextAdvance 公司)、Cyto-Flex 流式细胞仪(美国Beckman公司)。

　　2 方法

　　2.1 小鼠脾脏细胞的分离

　　将小鼠腹腔麻醉后，颈椎脱臼处死，75%酒精将小鼠浸泡15 min;在超净台中取出小鼠脾脏，去除筋膜后反复用PBS冲洗至无血色;将脾脏置于200目细胞筛上，注射器研磨，用PBS冲洗6次后置于培养皿中;收集细胞悬液，1 500 r/min离心10 min，弃上清;加入10%红细胞裂解液适量，室温静置10 min，1 500 r/min离心10 min，弃上清;PBS清洗3遍，1 500 r/min离心10 min，弃上清;加入0.85%NaCl溶液重悬沉淀;密度梯度离心加样，1 800～2 000 r/min离心40 min;收集目标分层，PBS清洗3遍;RPMI-1640完全培养基重悬细胞沉淀，调节细胞浓度为1×108，转入培养瓶中37 ℃、5%CO2孵育3 h，去除贴壁细胞，收集悬浮细胞进行后续实验。

　　2.2 CCK8法检测FKQ对脾淋巴细胞的增殖作用

　　将FKQ设置成10、20、30、40、50 μg/mL，不同药物浓度孵育小鼠脾淋巴细胞24 h、48 h和72 h。将处理完成的细胞制备细胞悬液，将1×104的细胞数接种到96孔板中，每孔约100 μL细胞悬液，每个浓度设3个复孔，培养12 h使其贴壁。每孔加入10 μLCCK8继续培养1 h后，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，吸光度值与细胞的增殖能力成正比。

　　2.3 MTT法检测FKQ对ConA诱导脾淋巴细胞增殖的影响

　　细胞分离、接种方法同前，参考文献[6]，本实验分为空白组，模型组(ConA，5 μg/mL)，FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分别干预ConA诱导脾淋巴细胞。于37 ℃，5%CO2培养箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法检测FKQ对ConA诱导脾淋巴细胞增殖功能，测定方法同CCK8法。

　　2.4 MTT法检测FKQ对LPS诱导的脾淋巴细胞增殖的影响

　　细胞分离、接种方法同前，参考文献[7]，本实验分为空白组，LPS组(LPS，10 μg/mL)，FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分别干预LPS诱导的脾淋巴细胞。于37 ℃，5%CO2培养箱中作用24 h、48 h和72 h，MTT法检测LPS诱导脾淋巴细胞增殖功能。

　　2.5 流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+亚群的变化

　　将脾淋巴细胞(1×108)加入24孔板，设空白组、ConA组(ConA，5 μg/mL)和FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30、50 μg/mL)分别干预ConA诱导脾淋巴细胞。每组均有3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育48 h，离心收集细胞，磷酸盐缓冲溶液清洗，然后使用小鼠单克隆抗体CD4+-FITC或者CD8+-FITC孵育后磷酸鹽缓冲溶液清洗，流式检测CD4+和CD8+的百分比。

　　2.6 ELISA法检测细胞上清中IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的含量

　　将脾淋巴细胞(1×108)加入96孔板，设空白组(不做任何刺激)、ConA组(ConA刺激)、LPS组(LPS刺激)和FKQ组：不同浓度的FKQ(10、30和50 μg/mL)分别干预ConA诱导脾T淋巴细胞和LPS诱导脾B淋巴细胞，每组均有3个复孔，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，孵育48 h，收集细胞上清，2 000 r/min室温离心5 min，取上清，按说明书操作，经酶标仪测定OD值。

　　2.7 统计学处理

　　使用SPSS 22.0统计学软件整理数据，计量资料以“x±s”表示，当数据符合正态分布时，多组间比较使用单因素方差齐性分析(One-way ANOVA)，当P<0.05时差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 FKQ对脾淋巴细胞的增殖作用

　　对小鼠脾淋巴细胞分别孵育24 h、48 h和72 h后，结果发现，当细胞孵育24 h，浓度为10、20 μg/mL的FKQ对小鼠脾淋巴细胞增殖无差异(P>0.05);浓度在30、40、50 μg/mL时对细胞增殖有着显著的促进作用(P<0.01)。当孵育细胞48 h，与浓度为10 μg/mL的FKQ相比，浓度在20、30、40、50 μg/mL时能明显增加脾淋巴细胞增殖(P<0.01)，且随着剂量的增加其增殖作用越明显。细胞孵育72 h后，30 μg/mL的FKQ对细胞增殖有促进作用(P<0.05);40、50 μg/mL的FKQ对细胞增殖促进作用更为明显(P<0.01)。其他浓度组的细胞存活率无显著性差异，说明各浓度组药物对细胞无明显毒性。与培养24 h相比，FKQ浓度为10、30、50 μg/mL时，培养48 h与72 h，对小鼠脾淋巴细胞增殖无影响(P>0.05);FKQ浓度为20、40 μg/mL时，培养48 h时能明显促进细胞增殖(P<0.01)。见表1。

　　3.2 FKQ对ConA诱导脾T淋巴细胞增殖的影响

　　由表2可知，与ConA组相比，10～50 μg/mL的FKQ对T淋巴细胞的增殖具有显著性差异(P<0.01)，有显著的量效关系，但只在24 h时剂量依赖性最明显;细胞孵育48 h及72 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异较小，而当其浓度达到50 μg/mL时，其差异变化较大。

　　3.3 FKQ对LPS诱导脾B淋巴细胞增殖的影响

　　由表3可知，LPS在不同的孵育时间对B淋巴细胞都有明显增殖促进作用;10～50 μg/mL的FKQ对B淋巴细胞的增殖存在明显差异(P<0.05，P<0.01)，在细胞孵育24 h及72 h时剂量依赖性最明显;当细胞孵育24 h及72 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异较小，而当其浓度达到50 μg/mL时，其差异变化较大。当细胞孵育48 h时，FKQ浓度在10 μg/mL和30 μg/mL时对细胞增殖作用差异最大，浓度在50 μg/mL时，其差异最小。

　　3.4 FKQ对小鼠脾淋巴细胞中CD4+和CD8+亚群的影响

　　如图1所示，与对照组相比，在ConA的刺激下，CD4+ T细胞比例显著升高(P<0.01)，而随着FKQ的浓度升高CD4+ T细胞的比例出现增加的趋势，但低浓度FKQ与ConA协同效果不明显，而当FKQ达到中、高浓度时开始与ConA产生协同作用(P<0.01);经ConA刺激后CD8+ T细胞比例降低;中、高浓度FKQ协同ConA能显著升高CD4+/CD8+比值，调节机体免疫功能(P<0.01)。说明中、高浓度的FKQ与ConA能产生协同作用，调节机体免疫平衡。

　　3.5 FKQ对小鼠脾淋巴细胞INF-γ、IL-2、IL-4及IL-10表达的影响

　　表4结果显示，与空白组相比，单用ConA和LPS刺激均能显著增加IFN-γ、IL-2的含量，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05);与单用ConA及LPS刺激相比，ConA协同50 μg/mL FKQ能促进IL-2的表达，LPS协同不同浓度的FKQ对IFN-γ、IL-2的表达均有显著促进作用(P<0.01)，同时结果发现，与空白组相比，ConA及LPS的刺激显著降低了细胞中IL-4的表达(P<0.01，P<0.05)，而增加IL-10的表达(P<0.01)。与单用ConA及LPS刺激相比，FKQ协同ConA、LPS刺激均能降低IL-4、IL-10的表达，尤以中、高浓度最为显著(P<0.01)。

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文章名称： 妇科千金胶囊对小鼠脾淋巴细胞免疫活性的研究

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