雌性大鼠手术去势骨质疏松症模型建立及评价

　　〔摘要〕 目的 从动情周期、骨密度、骨组织形态结构和原代骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)生长曲线4个层次判定雌性大鼠手术去势造模是否成功。方法 30只2月龄SPF级雌性大鼠，随机平均分为空白组、假手术组和模型组3组。手术去势造模完成后次日起连续7 d对3组大鼠进行阴道脱落细胞涂片，判断动情周期。造模后第8天取左侧股骨组织做骨密度测定和HE染色，取右侧骨组织分离原代BMMSCs。结果 空白组和假手术组动情周期正常，模型组大鼠动情周期紊乱;骨组织HE染色显示模型组骨小梁稀少且间距加大;与空白组比较，假手术组骨密度和BMMSCs生长速率差异无统计学意义(P>0.05)，与假手术组相比，模型组骨密度显著降低，BMMSCs生长速率显著下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 造模成功后的雌性大鼠动情周期紊乱，骨密度降低，骨小梁疏松，BMMSCs的生长缓慢，为骨质疏松症动物模型建立判定提供较全面的依据。

　　〔关键词〕 去势雌性大鼠;骨质疏松症;动物模型;动情周期;骨密度;骨髓间充质干细胞

　　根據国家统计局调查显示[1]，我国65岁以上人口接近1.4亿(约占总人口的10.1%)，是世界上老年人口绝对数最多的国家。有专家预测[2]，2050年我国用于治疗原发性骨质疏松症性骨折费用将达1 630亿元。随着人口老龄化趋势的日益加重，骨质疏松症将成为我国重要的公共健康问题，因此，开展骨质疏松症研究具有较高的科学价值。目前，骨质疏松症的发病机制尚不明确，在针对骨质疏松症发生机制开展的各种研究方法中，动物模型是目前较为常用的一种研究方法。造模方法中的手术去势是指通过去除雌性大鼠双侧卵巢的方法造成雌激素水平急剧下降、骨量大量丢失，建立骨质疏松症模型，具有建模因素单一、建模成功率高、可重复性好、可信度高和能够很好地体现雌激素水平下降这一重要病理生理现象等优点[3]。本实验采用雌性大鼠作为研究动物[4]，通过阴道脱落细胞涂片、股骨密度测定、骨组织形态和原代骨髓间充质干细胞。

　　marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)生长曲线4个层次的客观指标来判定造模是否成功[5]。

　　1 材料

　　1.1 动物

　　SPF级SD雌性大鼠，许可证号：SCXK(湘)2016-0002，体质量190～250 g，6～8周龄，30只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，于湖南中医药大学清洁级动物实验中心饲养，实验单位许可证号：SYXK(湘)2013-005。动物分笼饲养。环境温度为(22±4) ℃，湿度为50%±10%，自由进食进水，饲料为标准普通饲料(湖南中医药大学动物实验中心提供)，并保持环境安静，定时清扫鼠笼卫生。实验过程中对动物的处置符合实验动物管理和使用委员会的要求，适应性喂养1周后进行试验。

　　1.2 试剂

　　低糖DMEM基础培养(美国Gibco公司，批号8657263);FBS胎牛血清(美国Gibco公司，批号42A0071K);双抗(美国Gibco公司，批号1999384);Trypsin-EDTA(美国Gibco公司，批号1868583);PBS(美国Hyclone公司，批号AD1779227);CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司，批号20190124);FITC anti-mo/rat CD29抗体(美国eBioscience公司，批号11-0291-80);FITC anti-rat CD90抗体(美国Biolegend公司，批号206105);CD34(美国Abcam公司，批号ab81289);CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美国Proteintech公司，批号SA00013-2)等。

　　1.3 仪器

　　HR30-IIA2型生物安全柜(中国海尔集团公司);311型CO2培养箱(美国赛默飞世尔科技公司);AE2000型倒置显微镜(中国麦克奥迪实业集团公司);低速离心机(美国莱伯特公司);DCW-3510型恒温水浴锅(中国宁波新芝生物科技股份有限公司);全身双能X线骨密度仪(北京中西远大科技有限公司);MIAS型医学图像分析系统(成都泰盟软件有限公司);Ni-U型研究型正置显微镜(日本株式会社尼康公司);A00-1-1102型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司)等。

　　2 方法

　　2.1 动物分组及造模

　　按照随机数字表法将30只SPF级雌性大鼠分为空白组、假手术组和模型组3 组，每组10只。模型组采用去除雌性大鼠双侧卵巢方法建立绝经后骨质疏松症模型[5-6]，现配10%的水合氯醛溶液，浓度为3 mL/kg。假手术组和模型组大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，俯卧位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿第一胸腰椎两侧外1 cm处纵向切开皮肤肌肉，分离找到卵巢，结扎后完整摘除两侧卵巢，分两层缝合切口，用无菌生理盐水冲洗伤口，络合碘消毒[7]。术后连续3 d在假手术组和造模组大鼠后腿肌肉内侧注射青霉素，每只4万IU/d，6 d后拆线，空白组不做任何处理。

　　2.2 雌性大鼠阴道脱落细胞涂片

　　造模后第1天清晨10点，取空白组、假手术组和模型组3组大鼠，用小号无菌棉签进入大鼠阴道内，轻轻旋转棉签后，将阴道分泌物涂抹在已经滴加了少量生理盐水的防脱玻片上(均匀平铺即可)，待玻片自然风干后进行HE染色，1次/d，连续7 d。将7 d的玻片收集到一块进行HE染色。

　　2.3 骨密度测定和骨组织HE染色观察微细结构

　　造模后第8天，采用颈椎脱臼法处死所有动物。左侧股骨組织用于骨密度测定和骨组织HE染色。每组5只雌性大鼠左后肢用湿纱布包裹，送至湖南中医药大学药学院实验中心送检，用Unigamma X-RAY Plus双能X线骨密度仪检测雌鼠左后肢股骨密度。每组另5只雌性大鼠左后肢去除毛发后固定在4%PFA中，在5%的硝酸中脱钙7 d，进行HE染色[8]，检测股骨病理形态学变化。

　　2.4 BMMSCs的分离

　　造模后第8天，各组大鼠右侧骨组织均用于提取BMMSCs。全骨髓贴壁法分离BMMSCs及传代培养：清洁消毒操作区域，细胞房紫外消毒灭菌30 min，将大鼠右后肢在装有医用酒精的烧杯中浸泡2 min后剪去毛发及肌肉显露骨组织，剪断骨组织两端骨骺露出骨髓腔，用预先配制好的DMEM完全培养液冲洗骨髓腔，将冲洗液收集在无菌15 mL BD管中，离心去上清，加完全培养基进行重悬后，转移至25 cm2培养瓶中，做好组别和P0代标记。

　　2.5 BMMSCs的鉴定

　　细胞培养至P2代后对细胞进行鉴定。各取100 μL细胞悬液，分别加入到含抗体的离心管中，每种抗体分成5份，3种抗体总计15管，混匀，4 ℃避光孵育30 min，同时设置一管不染抗体管，具体标记如下(未染：不加抗体，不做染色;CD34：染CD34抗体;CD29：染CD29-FITC抗体;CD90：染CD90-FITC抗体)，PBS洗细胞2次，800 rpm离心5 min;其中CD34管继续加入100 μL CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(1∶100稀释)，继续避光孵育1 h，PBS洗细胞2次，800 rpm离心5 min，350 μL PBS重悬细胞。上机检测，进行细胞形态学观察及表面标记抗原CD90、CD29和CD34的鉴定。

　　2.6 BMMSCs生长曲线测定

　　将P2代细胞胰酶消化，加入完全培养液终止消化后800 rpm离心5 min，去上清，重新加入完全培养液，对细胞悬液进行计数。经预实验发现，BMMSCs在浓度为2×104个/mL时，CCK-8试剂盒检测结果较为理想。该细胞生长周期为7 d，所以绘制完整的生长曲线需要7块96孔板。按2×103个/孔，每孔100 μL接种到96孔板当中，依次加入空白组、假手术组、模型组细胞悬液，每组做5个复孔。第1天，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，4 h后在450 nm波长处进行OD值测定，依次7 d，绘制BMMSCs的生长曲线。

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