扶正活血解毒方通过Wnt/β-catenin信号通路对口腔黏膜下纤维化的调控作用

　　〔摘要〕 目的 探索扶正活血解毒方對槟榔碱提取物(areca nut extract， ANE)诱导的口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis， OSF)Wnt/β-catenin 信号通路的作用机制。方法 体外培养大鼠口腔黏膜上皮细胞(epithelial cell， EC)，分为正常组、模型组、中药高/中/低剂量组和IWR-1组。以ANE为诱导剂，扶正活血解毒方含药血清为干预药物，以Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1为阳性对照物，采用CCK8检测EC细胞增殖;PCR检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表达;Western blot检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1蛋白的表达。结果 与正常组相比，模型组EC增殖水平提高，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表达增加，Axin基因及蛋白表达降低(P<0.05);与模型组相比，中药高、中剂量组EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表达降低，Axin基因及蛋白表达升高(P<0.05);与模型组相比，IWR-1组EC增殖水平降低，Wnt1、β-catenin、cylinD1基因及蛋白表达降低，Axin基因及蛋白表达升高(P<0.05)。结论 扶正活血解毒方可通过调控Wnt/β-catenin信号通路，抑制ANE刺激的EC增殖，逆转OSF癌前病变的形成。

　　〔关键词〕 口腔黏膜下纤维化;槟榔碱提取物;扶正活血解毒;Wnt/β-catenin信号通路

　　口腔黏膜下纤维化或称口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis， OSF)是一种口腔黏膜潜在恶性疾病[1-2]。其癌变率高达7%，WHO将OSF列为癌前状态[3]。流行病学调查表明，咀嚼槟榔是OSF主要的致病因素，但癌变机制尚不清楚，可能与槟榔的致癌成分槟榔碱、细胞因子、创伤及细胞免疫等关系密切[4-5]，尤其认为某些细胞因子参与了OSF的癌变过程，其中以Wnt与TGF-β1介导的信号通路最具代表性[6-8]。如何阻断TGF-β与Wnt信号通路细胞因子间的联系，将成为防治OSF癌变的关键。前期研究发现扶正活血解毒中药通过调控TGF-β1/Smads信号转导通路能具有抑制槟榔碱提取物(areca nut extract， ANE)刺激的EC细胞增殖的作用[9-11]。本研究将从Wnt/β-catenin信号转导通路的角度探讨扶正活血解毒方对OSF癌前病变的作用机制，为临床OSF癌变的防治提供新的实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验细胞 口腔黏膜上皮细胞(epithelial cell， EC)购自于中国上海赛百慷生物技术股份有限公司。收到细胞后，选择相差显微镜对细胞进行鉴定，镜下细胞为多角形，胞核大，培养皿中细胞铺满的位置显微镜下可见铺路石状。高倍镜下未见成纤维细胞。

　　1.1.2 实验药物 (1)槟榔提取物(ANE)购于深圳润慧生物科技有限公司。(2)扶正活血解毒方所用药物为颗粒剂，由广东三九制药有限公司生产，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。具体组方规格如下：丹參10 g，玄参10 g，当归10 g，红花5 g，生地黄10 g，白花蛇舌草10 g，夏枯草10 g，生黄芪10 g，薄荷10 g，白芍10 g，茵陈10 g，桔梗10 g。克数为生药剂量，为同一批次同一产地药材。将以上中药按处方量取14剂，一剂生药(共115 g)加入500 mL温开水冲泡并充分搅拌，使用水煎浓缩的方法将药物浓缩成500 mL液体，生药浓度为0.23 g/mL，药物现配现用。

　　1.1.3 含药血清 8周龄SPF级雄性SD大鼠20只由湖南中医药大学动物实验室提供，在SPF条件下适应性饲养1周。将大鼠随机分为正常组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组4组，每组5只，其中正常组以0.9%生理盐水组灌胃8 mL/只，中药高、中、低剂量组分别按照活扶正活血解毒方12、8、4 mL/kg灌胃[中药低、中、高剂量大鼠灌胃量按照成人每日用量的1、2、3倍定为等效剂量(正常成人体质量按60 kg进行换算)]，每日2次，连续灌胃7 d。大鼠末次灌胃1 h后，行心脏取血，4 ℃、1 500 r/min离心10 min，取上清56 ℃灭活30 min，将灭活后的血清通过0.22 μm滤器过滤除菌，配置成完全培养基备用[12-13]。

　　1.1.4 主要试剂 大鼠口腔黏膜上皮细胞完全培养液(上海赛百慷生物技术股份有限公司，批号RATiCELLM013);胰酶(美国Hyclone，批号SH30042.01);2.24 μg/mL DispaseⅡ酶(美国Gibco，批号25200-027);PBS(美国Hyclone，批号SH30256.01B);CCK8增殖检测试剂盒(日本DOJINDO，批号CK04);逆转录试剂盒(中国北京康为世纪，批号CW2569);Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒(日本TOYOBO，批号QPK-201);引物由Genecopoeia合成;Wnt1抗体(英国Abcam，批号ab15251);β-catenin抗体(英国Abcam，，批号ab32572);Axin2抗体(英国Abcam，批号ab32197);cylinD1抗体(英国Abcam，批号ab251892);IWR-1(美国MCE，批号HY-12238);羊抗兔二抗(英国Abcam，批号ab6747);显色液(美国Cyanagen，批号23423)。

　　1.1.5 主要仪器 全自动化学发光免疫分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司，型号UniCelDxI 800);Nanno Drop 分光光度计(美国赛默飞世尔科技公司，型号NDoneC);基因扩增仪(美国MjRE-SEARCH公司，型号TTC-220);离心机(中国湖南湘仪，型号H1650R);Motic显微镜(成贯仪器上海有限公司，型号BA210T);酶标仪[美谷分子仪器(上海)有限公司，型号SpectraMax M4]。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞分组及培养 分离培养的细胞增殖至对数期，将细胞分为正常组、模型组、中药高剂量组、中药中剂量组、中药低剂量组、IWR-1组6组。其中正常组以正常大鼠血清干预，模型组以正常大鼠血清+50 μg/mL ANE干预，中药高、中、低剂量组分别以高、中、低剂量含药血清+50 μg/mL ANE干预，IWR-1组以正常大鼠血清+5 μmol/L IWR-1。

　　1.2.2 CCK8检测EC细胞增殖 将6组细胞按105/mL浓度接种于96孔板中，每孔100 μL，共铺5板，检测时间为12、24、36、48 h 4个时间点，在检测前2 h加入CCK8 10 μL/孔，37 ℃ 5% CO2继续培养至检测时间点，取出培养板，放置于酶标仪中，450 nm和600 nm双波长检测并读数[14-15]。

　　1.2.3 PCR检测Wnt1、β-catenin、Axin、cylinD1基因的表达 将6组细胞按105/mL浓度接种于T25培养瓶中，培养至细胞长满培养瓶，将其消化、离心、弃上清留存细胞。以RNA提取试剂盒提取细胞RNA，具体操作步骤根据试剂盒中的使用说明进行。RNA提取后，通过逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA，具体操作步骤根据逆转录试剂盒说明书进行。再根据反应体系将cDNA与SYBR溶液配比，进行PCR操作，并读取mean CT值和△△CT值

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