枸杞多糖对高糖环境下HRCEC增殖及VEGF表达的影响

　　〔摘要〕 目的 观察不同浓度的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide， LBP)对体外高糖环境下培养的人视网膜血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells， HRCEC)增殖及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)表达的影响。方法 获取人眼球摘除术后的HRCEC，予以体外培养，选取最佳状态的3～4代细胞;CCK8法检测在不同浓度LBP体外高糖环境下分别作用12、24、36 h后HRCEC的增殖情况;Western blot法检测各组HRCEC的VEGF表达情况。结果 同一时间组间比较，高糖组HRCEC活性及VEGF的表达量均高于低糖组(P<0.05);不同浓度LBP实验组HRCEC活性及VEGF表达量均明显低于高糖组(P<0.05)，80 μg/mL LBP组HRCEC活性及VEGF表达低于20 μg/mL LBP实验组与40 μg/mL LBP实验组(P<0.05);各实验组在干预36 h时， HRCEC活性及VEGF表达低于干预12 h与24 h(P<0.05)。结论 LBP能抑制高糖环境下HRCEC的增殖并下调VEGF的表达，并与LBP浓度和作用时间正相关。

　　〔关键词〕 枸杞多糖;人视网膜血管内皮细胞;血管内皮生长因子;高糖;新生血管

　　糖尿病視网膜病变(diabetic retinopathy， DR)发病率逐渐升高，世界范围内的糖尿病患者中，DR患病率约34%[1]，DR早期症状隐匿，极易导致失明[2]。DR发生的主要原因是视网膜缺血缺氧，血管内皮细胞增殖，VEGF高表达，最终视网膜新生血管(retinal neovascularization， RNV)形成，DR的主要并发症是视网膜出血与黄斑水肿(diabetic macular edema， DME)。玻璃体腔注射抗VEGF药物虽然是DR并发黄斑水肿的一线治疗方法[3]，但抗VEGF药物(雷珠单抗、贝伐单抗、阿柏西普、康柏西普等)价格昂贵、作用时间短[4]。寻求价格低廉、安全有效的抗VEGF药物成为目前DR研究的热点。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide， LBP)是一种天然水溶性多糖，药理作用广泛。LBP可以降低DM小鼠的视网膜炎症反应、氧化应激反应及血管新生[5]，LBP还可以抑制VEGF、Ang及其受体在DM小鼠视网膜中的表达，具有治疗DR的作用。既往虽然较多关于LBP在糖尿病、血管内皮细胞等方面的研究，但尚未发现在人视网膜血管内皮细胞(human retinal capillary endothelial cells， HRCEC)的相关研究，本文基于LBP对小鼠糖尿病VEGF抑制作用的基础上，研究了LBP对高糖环境下HRCEC及VEGF的影响，期望为研发防治DR新药物提供基础研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 主要试剂 胎牛血清(Gibco公司，货号04-001-1ACS);LBP(陜西康盛生物技术有限公司，KS118，纯度35%);兔抗人VEGF 抗体(博奥森公司，货号bs-0279R);β-actin(Mouse)、HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG(美国proteintech公司，货号依次为：66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2);高糖培养基(SIGMA公司，货号D5796);蛋白预染Marker(Thermo公司);SuperECL Plus超敏发光液(美国Advansta公司，货号K-12045-D50);胰酶消化液、RIPA裂解液(中国上海碧云天生物有限公司，货号C0201、P0013B);显影液、定影液(中国上海佳信公司，BW-61、BW-62);蛋白裂解液(中国上海碧云天公司，货号P0013B);TEMED(中国上海阿拉丁公司，T105497);SDS(中国大连美伦公司，货号MB2479);第Ⅷ因子相关抗原抗体(Abcam公司)。

　　1.1.2 LBP溶液的配制 LBP母液配置：称取35%含量LBP 10 mg，加入10 mL DMEM高糖培养基稀释，摇匀、溶解，500 r/min离心5 min，双层0.22 μm微孔滤膜过滤细菌及沉淀，并密封分装，4 ℃保存。此时母液配置完成，含量为1 mg/mL。配置实验LBP浓度，移取母液200 μL置于15 mL离心管中，加入DMEM高糖培养基至10 mL，反复摇匀，配置成20 ?滋g/mL LBP，做好标记，置于4 ℃冰箱保存。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 HRCEC的培养 在南华大学第二附属医院手术室选取角膜移植手术后余下的眼球，庆大霉素注射液浸泡30 min，分离视网膜神经上皮层，常温下2%胰蛋白酶消化，过滤，加入20%小牛血清培养液停止消化，1 200 r/min离心8 min，去除上清液，在离心管内加入10% Gibico FBS+1%双抗的DMEM培养基吹打混匀，接种于含有10% Gibico FBS+1%双抗的DMEM培养基，再置入37 ℃、5% CO2培养箱培养。待细胞铺满整个培养皿底部约80%时进行传代。

　　1.2.2 HRCEC鉴定 (1)细胞爬片;(2)固定：PBST洗涕，加入4%PFA(多聚甲醛)，4 ℃细胞培养箱30 min固定;(3)按照Western blot实验步骤进行破膜封闭、一抗孵育、二抗孵育;(4)包埋：抽取已二抗孵育好的细胞爬片，PBST缓冲液清洗，滴取1滴Fluoromount-G后盖玻片再盖上;(5)阳性染色镜检示：经过山羊抗小鼠IgG二抗橙红色DyLight594荧光标记。显微镜下观察并采集图像。

　　1.2.3 实验分组 取对数生长的细胞进行分组：(1)AL组：低糖对照组(低糖+细胞);(2)AG组：高糖对照组(高糖+细胞);(3)A1组：20 μg/mL LBP实验组;(4)A2组：40 μg/mL LBP实验组;(5)A3组：80 μg/mL LBP实验组。其中低糖浓度为1 g/L，高糖浓度为4.5 g/L;实验组为不同浓度LBP+高糖培养基+细胞。

　　1.2.4 CCK8法行细胞增殖活性的检测 取对数生长期的细胞，消化计数，以5×103个细胞/孔密度接种于96孔板内，每孔100 μL。各组均设5个复孔，培养贴壁，每孔加入10 μL/孔的CCK8，用完全培养基配置CCK8溶液，去除含药培养基每孔加入100 μL含有CCK8的培养基。37 ℃，5% CO2继续孵育4 h后于Bio-Tek酶标仪测定450 nm处吸光度(OD)值，测定各组HRCEC的增殖活性。

　　增殖抑制率=(高糖对照组OD值-药物干预组OD值)/高糖对照组OD值×100%

　　1.2.5 Western blot 蛋白检测 (1)PBS洗涤细胞，3 000 r/min离心2 min，加入120 μL RIPA裂解液，超声破碎1.5 min;冰上裂解;4 ℃，12 000 r/min离心15 min;取上清液。按照BCA法，测定550nm之间波长的吸光值，根据标准曲线计算蛋白浓度。(2)样品准备：取80 μL蛋白上清，加入20 μL 5*loading buffer混匀，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷备用。(3)电泳：点入marker 2 μL，其它按照分组顺序每孔上样15 μL已变性蛋白。恒定电压75 V，130 min。(4)转膜：分别切胶VEGF(24kD)，β-actin(42kD);300 mA恒定电流转膜，VEGF约39 min，β-actin 约60 min。(5)封闭：用1*PBST配制5%脱脂奶粉，室温封闭60 min，4 ℃过夜，次日室温放置30 min。(6)一抗孵育：加入一抗(Rabbit Anti-VEGF antibody (bs-0279R)，1∶1 000;Mouse anti-β-actin antibody(66009-1-Ig)1∶5 000，室温孵育90 min;1*PBST洗3次，每次15min。(7)二抗孵育：加入二抗(HRPgoatanti-mouse IgG，SA00001-1，1∶5 000;HRPgoat anti-rabbit IgG，SA00001-2，1∶6 000)温孵育90 min后1*PBST洗3次，每次10 min。(8)显色/曝光：化学发光法(chemiluminescence， ECL)显色曝光，显影冲洗，Image lab软件分析灰度值。

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