皮肤科中芯片的应用及探讨

来源:期刊VIP网所属分类:检验医学发布时间:2015-10-17浏览:

  对于皮肤科中芯片的应用有哪些呢,正确认识有关芯片应用时的一些技巧对皮肤又有什么危害或影响呢, 怎样来加强对这方面的管理呢?本文选自:《中华皮肤科杂志》,《中华皮肤科杂志》系中华医学会主办的中华系列杂志之一,由中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所承办。高、中、初级皮肤性病科医师、科研、预防、医疗和教学人员为主要读者。

  摘要:在皮肤科学研究中,被毛突变小鼠都是用来研究人类同源基因疾病良好的动物模型。国内外研究者已获得了20多个被毛突变系小鼠,如在皮肤、免疫及肿瘤领域得到广泛运用的裸小鼠;表皮病变引起被毛异常的hr小鼠和ic小鼠;章金涛等的豫医无毛小鼠;李善如等发现的被毛突变无毛小鼠等等。

  关键词:皮肤科,医学论文,论文发表

  QPCR芯片基本原理及相关应用

  每张QPCR芯片如同上百个QPCR微反应池的集成,每个微反应池都固定有基因特异性引物,当加入含有模板和荧光基团的QPCR反应体系后,在相同的反应条件下,不同的基因都能同时进行特异性扩增,每个微反应池的位置信息就代表了某个特定基因,利用荧光信号的积累实时监测每个微反应池中PCR反应的过程,最后通过标准曲线就能同时对上百个基因mRNA或cDNA进行准确定量分析[3]。与基因芯片相比,QPCR芯片的通量显着减低,一次至多检测96个或384个基因,基本相当于基因芯片通量的1%,但是QPCR芯片的扩增对象经过仔细选择,是某一组织或病变类型高度相关的基因,更便于数据的分析处理,检测基因还可以随研究需要加以改动,便于操作,而且价格比较低廉。基因芯片和QPCR芯片的原理不同,但对于基因表达谱而言,他们的检测对象(mRNA或cDNA)到实验结果(表达丰度),QPCR与基因表达芯片都高度一致,许多研究者都把这两种方法作为互相印证的手段,而对于几十个甚至几百个基因的表达丰度检测,QPCR技术完全可以取代基因芯片[4]。

  基因芯片通过对来源于不同个体(正常与患者)、不同组织或不同发育阶段组织细胞内的mRNA(经逆转录后产生的cDNA)进行检测,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性等进行综合的分析与判断,迅速将某个或几个基因与病变联系起来,也为进一步研究基因间相互作用关系提供参考。那么中等通量的QPCR技术是否能够解决同样的问题呢?答案是肯定的。计算机预测是将基因表达水平的数据与分子信号过程进行联系的关键步骤。

  目前广泛运用的软件是根据基因表达量的变化,计算机结合已知信号通路的信息,将“宏观表型”与分子信号过程结合。由于这一软件预测的基础是已知信号过程,并不能预测新的未知信号过程,所以对基因芯片的海量数据的利用率有限。而在QPCR芯片的设计过程中,研究者依据已知的信号过程选择检测对象,尽管选择的基因总数不多,但可能都是预测软件的参考基因,同样会得到较好的结果[5]。在当今生物科学和医学领域,QPCR作为一种新型实用研究工具得到了越来越高度的重视,其使用量逐年上升,但是QPCR芯片技术的应用才刚刚处于起步阶段。有关学者开始利用QPCR芯片技术进行多领域医学研究,取得了有突破性意义的成果。SamarS.Azab,SalamaA.Salama等[6]认为雌激素天然衍生物2-甲基雌二醇作为(2-me-thoxyestradiol,2ME),在临床试验中是乳腺癌一个重要的评价对象。他们在两种治疗组中通过QPCR芯片技术测试鉴定了Dox细胞毒性单独处理和协同2ME处理后细胞的基因表达差异。其研究主要目标是评估2-甲基雌二醇在对阿霉素多耐药性乳腺癌细胞(MCF-7/Dox)产生的调节影响及其潜在的作用机理。

  IrmaAiroldi,EmmaDiCarlo,ClaudiaCocco等认为IL-12RB2在人类B细胞恶性肿瘤中是最为肿瘤抑制基因存在作用的。大鼠IL-12基因敲出后自然产生了B细胞恶性肿瘤,而且有了肺上皮细胞肿瘤。但是IL-12没有能力对表达IL-12受体的B16黑色素瘤细胞有直接作用。他们利用QPCR芯片对大鼠IL-12基因正常组和敲出组进行测试,发现IL-12能通过抑制血管生成来降低表达IL-12受体的B16细胞的致瘤性[7]。AndreasHald,BirgitteRono等[8]认为除了在宿主防御方面表现明显的重要性,巨噬细胞已经被证明在不同的病态条件,包括慢性炎症、动脉粥样硬化和癌症中扮演一个有害的作用。而巨噬细胞活化和迁移与细胞外基质降解密切相关。这个过程可以通过多个蛋白水解酶完成。在这项研究中,他们利用QPCR芯片进行分析,发现LPS诱导基质金属蛋白酶的表达,同时降低基质金属蛋白酶抑制剂的表达。此外,基因间的比较的表达水平相关的蛋白酶透露他们之间存在较大的差异基因表达水平,凸显了巨噬细胞的基因表达调控的复杂性。除了这些文章还有学者分别对病原微生物检测[9][10]、炎症反应研究[11]等方面进了相关研究,得到了很好的研究成果。

  QPCR芯片在皮肤科学中的应用前景

  通常认为毛发多少与毛囊数量及毛囊发育周期相关,许多研究集中在毛囊本身及毛囊与皮肤微环境信号分子的相互关系上,如hid和sa等基因直接作用于毛球,引起毛发发育障碍[16],而经过皮肤病理学家JohnSundberg博士的鉴定,snthr-1Bao稀毛小鼠皮肤的主要病变是过度角化,导致毛发生长困难,毛囊的数目并未显着减少、主要形态结构基本正常。因此,snthr-1Bao小鼠和hr等小鼠一样,是表皮角化、毛发阻生、皮肤慢性损伤并发无菌性炎症的理想模型。仅从组织病理学来看,snthr-1Bao稀毛突变小鼠皮肤的原发病变与人类Alagile综合症比较相似。

  Alagile综合症为常染色体隐性遗传性疾病,临床表现为头皮斑秃和全身广泛毛发稀少,性腺功能减退,身材发育延迟等;病组织理表现为表皮轻度棘皮病样改变,角化过度而深入毛孔形成角栓,但目前该病分子机制尚未完全清楚[17],需要开发出相应的模型进行分子水平上的研究。“皮肤表达关键基因QPCR芯片”可以为这方面的研究提供了一种新的尝试。从QPCR芯片开发的角度,snthr-1Bao稀毛小鼠也是待开发的“皮肤表达关键基因QPCR芯片”很好的试验对象,可以为芯片的设计、优化及将来的推广应用提供了最直接的检验。再例如在皮肤科学中,瘢痕疙瘩是在皮肤创伤愈合过程中成纤维细胞过度增殖和胶原过度分泌所致的病理性瘢痕,目前尚无确切有效的药物。众多学者通过大量基础实验研究和临床证据表明,瘢痕疙瘩的发生机理与多个基因的功能活动密切相关。

  SmithJC,BooneBE,OpalenikSR[18]等通过使用QPCR研究发现降低Wnt信号表达的多种抑制因素对瘢痕疙瘩成纤维细胞表面这个基因的作用。同时发现在正常细胞中的诱饵受体IL-13Rα2是低表达,在瘢痕疙瘩中几乎不存在。得到QRT-PCR证实的有用结论是,支持在瘢痕疙瘩治疗中提高IL-13的活性。Chang等.(2002)[19]通过研究发现HOX基因在发育的胚胎阶段有重要作用,能够调节人的分化细胞,包括人类的真皮纤维母细胞,不同的HOX基因表达可能成为组成瘢痕疙瘩的恶性表型。魏斌,范金财等[20]运用RNAi干扰正常皮肤成纤维细胞前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)基因的表达,利用realtimeRT-PCR验证siRNA沉默效果;应用全基因组芯片检测基因表达谱变化。

  检测到与PTGS2基因相关的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同发挥作用的相关基因,证明PTGS2与瘢痕疙瘩的发病机制有着密切的关系,为治疗瘢痕疙瘩提供了一个潜在的候选靶点。BockO,YuH,ZitronS[21]研究了beta1-3和它们的受体IandII对皮肤纤维原细胞的影响。其他的一些基因,包括IGFBP-2,IGFBP-5,FZD7,HOXD,STAT1,IGFBP-3和HOXA,都位于染色体臂2q或者7p,都认为与瘢痕疙瘩形成有一定的关联(Marner-os,2004)[22]。因此研发相关的QPCR芯片,运用这种先进的技术手段,来探讨这些基因对于对于瘢痕疙瘩发生的作用机制;观察敲减或者改变这些基因的表达,是否导致正常皮肤成纤维细胞全基因表达谱向瘢痕疙瘩方向改变,以期在基因水平上探索无瘢痕创伤愈合的新途径。

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