来源:期刊VIP网所属分类:检验医学发布时间:2014-06-11浏览:次
【摘要】 FFPET的提取方法多种多样,如水煮法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、Chelex100提取法等[36],均旨在更加高效、高质量地提取DNA。石蜡包埋组织DNA提取的数量及质量与组织的量、消化时间、纯化方法等有关[7]。本实验对脱蜡、消化做了一些优化。
【关键词】 石蜡组织,DNA提取,Chelex,100提取法
医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织(formalin fixed and paraffin embedded tissues, FFPET),为分子病理研究提供了大量的信息来源。然而福尔马林固定后的蜡块包埋组织DNA降解严重[1],档存FFPET组织切取量有限,传统酚氯仿提取DNA步骤繁杂,提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用[2]。如何高效、高质量提取微量石蜡组织DNA对利用石蜡组织进行分子研究至关重要。本实验在前人及前期研究的基础上[3],进一步探讨改善石蜡包埋组织DNA的提取方法及各种方法在不同条件下的应用。
1 材料与方法
1.1 材料
选用海南医学院附属医院病理科2006~2007年间存档的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、结肠癌石蜡包埋组织各25例。所用物品包括PCR仪(Biometra)、蛋白酶K(Merck公司)、Taq DNA聚合酶(北京华美)、Chelex100(BioRad I~boratory)。
1.2 方法
黄幼生等.四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较
1.2.1 提取DNA方法 将每例石蜡包埋组织块切片6μm厚,分装于4个EP管中,每管5片(鼻咽癌组织10片),切不同病例的蜡块时用二甲苯擦洗刀片2遍,以免交叉污染。先统一去蜡:在每管中加入二甲苯1mL置于55℃恒温摇床中,20min后12000r/min离心10min,去上清,加入新鲜二甲苯重复一次;再用无水乙醇洗涤2次以脱去二甲苯,离心后弃上清,在55℃恒温箱干燥沉淀。采用4种方法提取DNA:(1)单纯消化法:用100μL的组织裂解液(0.2%SDS,10mmoL/L TrispH8.0,0.5mmoL/LEDTApH 8.0)悬浮沉淀,加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)消化,55℃振摇8h或过夜至溶液澄清。98℃加热10min灭活蛋白酶K,冰上3min,12000r/min 离心取上清(DNA在上清液中),4℃储存备用。(2)Chelex100提取法:步骤同单纯消化法,提取上清后,在上清液中加入5%Chelex100颗粒,4℃过夜储存备用。(3) 酚氯仿抽提法:在EP管中加入200 mL蛋白酶K缓冲液(50 mmol/L TrisHCl pH 8.0,5 mmol/LEDTA pH 8.0,0.2%Tween20)及5 μL 蛋白酶K(20mg/mL),置55℃水浴振摇过夜,取出后煮沸10min,离心,取上清;用等量酚—氯仿—异戊醇抽提2次;加2.5倍冰无水乙醇(-20℃)和1/10体积3mol/L乙酸钠沉淀DNA,-20℃静置3h;取出后4℃下14000 r/min 离心15min,弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀2次,室温通风干燥沉淀后用50μL TE液(pH8.0)溶解DNA,4℃保存。(4)水煮法:在EP 管中加入100μL 去离子水。室温静置2h后98℃加热15min,12000r/min离心10min后取上清即为模板DNA。
1.2.2 PCR扩增 选择3对多态性位点引物,由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列、退火温度及扩增片段长度见表1。PCR反应体系为25μL,10×PCR反应缓冲液2.5μL;25mmoL/L MgCl21.5μL;10mmoL/L dNTP0.5μL;10vmoL/L引物各1μL;模板2μL;5U/μL Taq聚合酶0.5μL,余下由灭菌去离子水补足。经94℃变性5min后进入循环:94℃变性30min;退火45s;72℃延伸30s,完成35个循环后.于72℃下延伸5min。每次PCR反应均设阳性、阴性对照。
表1 PCR扩增所用引物列表
引物名称序列长度(bp)退火温度(℃)
D1S3466ATGTCTTTGATCCTATGGAAGG18920956
TGGGTAACAGACCCTGTCTC
SS903GTCAGGGCGTCTTCCCAGTT28560
TGAGCCTCGGCATCTACATCTT
SS448AGGCGTGTCCTTTCGTTTCT46861
GCCACTCCCACTGCTCAA
1.2.3 DNA鉴定方法 (1)DNA质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定:取5μL DNA加1μL的DNA loading buffer混匀上样,在2%的琼脂糖凝胶中80V电泳30min,在紫外凝胶成像仪下观察所提取DNA基因组及PCR产物的质量并拍照存档。(2)DNA纯度量鉴定;各取5μLDNA样品,加水至500μL混匀后,转入分光光度计的石英比色杯中,先用500μL水校正零点,于260nm和280nm处分别读出吸光度(OD)值,检测DNA的OD值。
2 结果
海南医学院学报 Vol.16 No.9 Sep.2010
4种方法提取的DNA经凝胶电泳分析显示,Chelex100提取法、单纯消化法提取的DNA100%有条带出现,主要集中在400~1000bp;水煮法提取的DNA46.3%有条带出现,主要集中在100bp以下;传统酚氯仿提取的DNA15%有条带出现,主要集中在500~1500bp之间。4种方法提取的DNA经分光光度计测定显示Chelex100提取法、酚氯仿抽提法提取的DNA纯度无明显差异(P>0.05),但优于另外2种方法(P<0.05)。4种方法提取的DNA量及纯度见表2。
表2 4种方法提取的DNA平均纯度及产量(n=100)(±s)
提取方法纯度(260/280)DNA产量(μg/100mg)
Chelex100提取法1.73±0.3352.9±8.76
单纯消化法 1.18±0.31 55.4±10.41
水煮法 1.03±0.23 3.1±0.25
酚氯仿抽提法 1.78±0.29 1.2±0.57
4种方法提取的DNA进行PCR扩增,小于200bp长度片段扩增,Chelex100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%,明显优于酚氯仿抽提法(15.0%)及水煮法(21.3%)(P均<0.01)。随着扩增长度的增加,PCR扩增效率逐渐降低,285bpDNA片段4种方法PCR扩增效率分别为86.8%(Chelex100提取法)、67.5%(单纯消化法)、13.8%(水煮法)、12.5%(酚氯仿抽提法)(图1);485bp扩增效率分别为71.3%、52.5%、5%、12.5%。总的PCR反应阳性率分别为82.5%、66.5%、13.4%、13.4%。1年后4种方法提取的DNA重复PCR扩增,小于200bp片段PCR扩增阳性率无明显变化,但大于200bp片段扩增效率明显降低,总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。
注:1:Marker(100bp/band);24:Chelex100法;57:单纯消化法;810:酚氯仿法;1113:水煮法;14:阳性对照;15:阴性对照
图1 不同方法提取的DNA PCR反应电泳图(引物SS903)
3 讨论
新鲜组织的收集及长期保存困难,各医院存在大量各种疾病的石蜡包埋组织,石蜡包埋组织DNA的提取解决了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的这一难题[3]。
在剔除多余的蜡块后,把二甲苯脱蜡的时间、次数缩短,由传统的 3 h以上缩短到 1 h左右,同时减少操作步骤,这样就减少操作过程中DNA的丢失、断裂,达到减少原始蜡块组织成本的目的。消化过程中,消化时间过长可以充分消化组织,提高DNA的含量及纯度,然而时间的延长,又使得DNA断裂增加,且不利于连续操作,本实验选取消化时间主要以组织消化彻底,组织消化液变清亮为标准,微量石蜡组织在10~12h左右即可消化充分,无须消化3~4d。常规的纯化方法是酚氯仿反复抽提,随后高盐沉淀DNA、乙醇洗涤、干燥后溶解保存。这种方法步骤繁杂,DNA损失严重,微量石蜡组织通常看不到沉淀,而至提取失败。通过实验观察发现,石蜡组织中的蛋白质,均已变性,充分消化后对PCR反应造成的影响有限,对PCR反应影响较大的是其中的金属离子。Chelex100是一种金属离子螯合剂,能与镁、钙等核酸反应必需的二价金属阳离子螯合,从而保护DNA,并减少由降解的DNA片段形成的杂带,从而提高PCR反应阳性率及重复率[3]。
酚氯仿抽提法是最为经典的提取方法,主要包括二甲苯脱蜡、蛋白酶K消化、苯酚/氯仿纯化、盐析4个步骤。由于操作过程过多,频繁移管,导致DNA损失、污染以及DNA断裂的可能。本实验结果显示该方法所提取的DNA质量较高,易于保存(1年后,PCR重复率为100%)。但需组织量多,提取效率低下,综合提取率仅为5%,其中鼻咽癌由于活检组织太小,提取率为零。因而该方法仅适用于需长期保存的大标本DNA提取。水煮法提取的DNA数量少,片段小,不易保存,重复率低,不适合长片段DNA分析,但操作简便,所需时间短,可应用于快速的短片段DNA鉴定。简单消化法与Chelex100法操作过程较简便,改良后只需12h左右即可完成。简单消化法提取的DNA含量与Chelex100法无明显差异,但纯度较低,PCR阳性率低于后者,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。单纯消化法1年后的重复率下降较大,不易于保存;Chelex100法提取的DNA纯度较单纯消化法高,与其他方法相比,PCR阳性率及1年后重复率最高,与其他方法相比,差异有显著性(P<0.01)。因而Chelex100法最适用于一般的FFPET的DNA提取,且易于保存。
总之,甲醛固定石蜡包埋组织是一种信息含量大且经济的宝贵资源,但其中的核酸降解严重,如何高效高质提取其中的DNA来满足进一步实验研究要求值得探讨。Chelex100提取法方便简单,适用于微量石蜡组织DNA扩增分析;单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。
期刊VIP网,您身边的高端学术顾问
文章名称: 对比研究四种微量石蜡组织DNA提取方法
文章地址: http://www.qikanvip.com/jyyx/13433.html