分子印迹传感器能量转移电化学发光法检测赤霉素

　　摘 要 制备了赤霉素(GA3)分子印迹传感器，建立了基于共振能量转移原理增强Ru(bpy)3Cl2电化学发光(ECL)信号超灵敏测定GA3的方法。在玻碳电极表面滴涂掺杂Au的g-C3N4材料(g-C3N4/Au)，进一步电化学聚合邻苯二胺，得到分子印迹聚合物(MIP)膜，采用甲醇-乙酸洗脱液洗脱后，得到可特异性识别GA3的空穴。以Ru(bpy)32+为探针，g-C3N4/Au为能量供体，利用二者间共振能量转移增强Ru(bpy)32+的ECL强度。同时，ECL共振能量转移与分子印迹技术结合，提高传感器的选择性。随着样品中GA3浓度增加，分子印迹空穴与GA3重新结合， 导致ECL强度逐渐降低。此传感器检测GA3的线性范围为4.0×10-14～7.0×10-11 mol/L，检出限为1.64×10-14 mol/L。将此传感器用于啤酒中GA3检测，回收率为95.7%～103.7%。

　　关键词 分子印迹; 赤霉素; 电化学发光; 共振能量转移; g-C3N4/Au

　　1 引 言

　　分子印迹电化学传感器是能选择性识别特定分子并产生信号变化的检测装置[1]，广泛应用于环境分析、食品安全、生物医药检测等领域[2，3]。然而，传统的分子印迹电化学传感器因受限于分子印迹聚合物(MIP)导电性弱和电活性差， 导致其灵敏度不高。分子印迹电化学发光法集电化学发光(ECL)的高灵敏度和分子印迹技术的高选择性于一体，有较好的发展前景[2，4]。然而，常规的ECL强度因受施加电位影响，产生光子能量较高但数量较少，灵敏度相对较低。电化学发光共振能量转移(ECL-RET)利用供体在电极表面发生电化学反应后， 将能量转移给受体，使受体吸收能量而发光，可显著提高ECL分析灵敏度[5，6]，因而在DNA、蛋白质、细胞及无机分子检测等研究中得到应用[7～10]。

　　赤霉素(GA3)是植物生长发育不可缺少的激素之一，在育苗、保护地栽培以及露地栽培等方面广泛使用。但是，GA3会影响动物的生长发育，甚至导致机体发生癌变，因此检测GA3具有重要意义。目前，检测GA3的方法有液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、伏安分析法、表面增强拉曼散射法等[11～14]，但这些方法存在灵敏度不高、选择性差、需要复杂的前处理、仪器昂贵、溶剂用量大等缺点。本研究组曾利用分子印迹ECL传感器测定GA3[15]，但该方法灵敏度仍有待提高。

　　g-C3N4是一种高效、稳定的发光材料，已被用于制备多种类型的化学传感器[16]。g-C3N4/Au的发射峰与Ru(bpy)3Cl2的吸收峰相近，可发生能量转移而得到更强的ECL信号，提高检测灵敏度[17]。在此基础上，本研究构建了以g-C3N4/Au为基质的分子印迹传感器，利用g-C3N4/Au供体与Ru(bpy)3Cl2受体间发生能量转移从而大大增强ECL信号的ECL共振能量转移原理，结合“门控制”效应[18]，提高检测的灵敏度。传感器制备过程及检测原理如图1所示。在玻碳电极上修饰一层g-C3N4/Au材料，以GA3作为模板分子，邻苯二胺作为功能单体，电聚合制备分子印迹传感器。将模板分子洗脱后，得到可识别GA3的印迹空穴。施加电压，使g-C3N4/Au处于激发态，当Ru(bpy)32+通过空穴到达电极表面，激发态g-C3N4/Au的能量转移到Ru(bpy)32+，使ECL信號增强，实现对GA3的高灵敏检测。

　　2 实验部分

　　2.1 仪器与试剂

　　PGSTAT128N Autolab电化学工作站(瑞士万通有限公司); MPI-E型电化学发光分析系统(西安瑞迈仪器有限公司); PHS-3C型实验室pH计(上海锦幻仪器仪表公司); 80-2B离心机(金坛市医疗仪器厂); AVANCE III Bruker-500 MHz核磁共振仪(荷兰Bruker公司); ∑IGMA场发射扫描电子显微镜(德国卡尔蔡司公司); TU-1901紫外-可见光分光光度计(北京普析通用公司); JEM-2100F场发射透射电子显微镜(日本电子株式会社); 日立F-7000荧光分光光度计(株式会社日立制作所)。采用三电极系统：工作电极为直径2 mm的玻碳电极(GCE)，对电极为铂丝电极，参比电极为Ag/AgCl。

　　邻苯二胺、GA3和联吡啶钌(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 三聚氰胺(C3H6N6，国药集团化学试剂有限公司); 二水合柠檬酸三钠、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl(汕头陇西化工厂); NaBH4(国药集团化学试剂有限公司)。 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液(含0.1 mol/L KCl，pH 8.0); 0.2 mol/L硼酸-硼砂缓冲液(含0.1 mol/L KCl，pH 9.0); 0.005 mol/L K3[Fe(CN)6]-K4[Fe(CN)6]溶液(含0.1 mol/L KCl)。 所用试剂均为分析纯，无需纯化。实验用水为蒸馏水。

　　2.2 修饰材料的制备

　　2.2.1 g-C3N4的制备 参照文献[19]合成g-C3N4。准确称取10 g三聚氰胺， 均匀地放入带盖的陶瓷坩埚中，将其放入马弗炉中进行高温烧结：在120 min内升温至500℃并恒温反应120 min，再加热到520℃恒温反应120 min，自然冷却至室温，取出样品，研磨过筛，即得到g-C3N4的粗品。

　　参照文献[20]对所得粗品进行提纯：将制得的g-C3N4粗品溶于水中，超声处理30 min， 离心并水洗3次，去除可溶性的反应物和杂质，再用无水乙醇清洗并离心3次，以去除一些有机杂质，在60℃下干燥，将所得样品研磨至粉末，备用。

　　2.2.2 g-C3N4/Au的制备 参照文献[20]合成g-C3N4/Au。准确称取10 mg g-C3N4溶于4 mL去离子水，超声处理30 min，然后加入20 μL 0.1 mol/L HAuCl4。超声处理10 min，搅拌30 min，重复3次。加入126 μL 0.04 mol/L NaBH4，搅拌20 min。继续加入200 μL 0.01 mol/L柠檬酸三钠，继续搅拌30 min。离心并水洗3次，去除可溶性的反应物和杂质，最后溶于4 mL水中。

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