定量核磁共振碳谱同时测定食用油中甘油三酯的sn-1,3和sn-2脂肪酸含量

　　摘 要 建立了定量核磁共振碳谱(13C-qNMR)技术测定食用油中特定位置不饱和脂肪酸含量的方法。使用反转门控去耦技术对食用油中的脂肪酸进行位置特异性分析，针对未完全分离的谱峰，比较了直接普通积分、使用不同的洛伦兹/高斯函数比值去卷积积分等数据处理方式对核磁共振碳谱定量结果的影响，选择以洛伦兹-高斯(3：2)的比例，对谱图进行去卷积拟合，提取sn-1，3和sn-2位亚油酸和油酸两种不饱和脂肪酸的定量峰，测定3种食用油中甘油三酯的饱和脂肪酸、sn-1，3位亚油酸、sn-2位亚油酸、sn-1，3位油酸、sn-2位油酸含量分别为：大豆油(16.2%、27.8%、24.0%、15.5%、7.9%(w/w，下同));玉米油(15.3%、30.7%、20.5%、20.1%、13.3%);花生油(18.3%、18.7%、12.5%、24.9%、25.5%)。大豆油中sn-1，3位亞麻酸、sn-2位亚麻酸分别为4.5%和4.0%，玉米油和花生油中未检出亚麻酸。上述结果与1H-qNMR测定的各脂肪酸总量一致。13C-qNMR可对食用油中脂肪酸进行位置特异性分析，无需复杂的样品前处理过程，可区分不饱和脂肪酸的不同位置分布，为在缺乏甘油三酯标样的情况下测量食用油中特定甘油三酯位置异构体成分含量提供了新方法。

　　关键词 定量核磁共振波谱法;核磁共振碳谱;食用油;脂肪酸;位置异构体

　　1 引 言

　　食用油是人体所需脂肪和能量的重要来源[1]，也是体内必需脂肪酸的主要来源。目前，市场上常见的食用油多为植物油，如大豆油、玉米油、花生油和橄榄油等。甘油三酯(TAGs)是食用油的主要成分，因其甘油骨架上结合的脂肪酸不同而种类繁多[2]，其中的亚麻酸、油酸、亚油酸以及棕榈酸等饱和脂肪酸的摄入量与多种慢性疾病有关[3～6]。食用油中脂肪酸的主要分析方法有气相色谱法(GC)[7～11]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[12～14]等。这些方法需要复杂的样品前处理过程，即将甘油三酯转酯化为沸点较低的脂肪酸甲酯再分析[15]。Barison等[16]提出了一种简便的核磁共振氢谱(1H-NMR)方法，测定食用油中脂肪酸的相对含量，快速简便，且无需复杂的样品前处理过程，测定的脂肪酸结果与AOAC的气相色谱法一致。

　　脂肪酸在甘油骨架中还存在位置特异性，可根据sn-1、sn-2、sn-3(sn： stereospecific numbering)编号区别各脂肪酸在甘油骨架的位置[7]，其结构如图1所示。脂肪酸的位置对油脂的物理性质、生物化学性质和营养价值都有重要影响[17]。位于sn-2位的脂肪酸通过肠壁以甘油单酯的形式被吸收[18]，可能对动脉粥样硬化、血脂和脂蛋白原形成不同的急性或慢性作用，并增加患心血管疾病的风险[19～21];而位于sn-1，3位的脂肪酸则作为游离的脂肪酸被人体吸收。研究表明[22，23]，棕榈酸在甘油骨架的sn-2位具有促进婴幼儿对矿物质吸收的作用;而sn-1，3位的棕榈酸则很容易被肠道内脂肪酶水解成游离棕榈酸，与钙、镁等矿物质发生皂化反应，降低人体对脂肪的吸收利用效率。因此，对甘油三酯中的脂肪酸进行区域特异性分析非常重要。

　　脂肪酸在甘油骨架上的位置分析通常通过酶水解、格氏化学降解和色谱分析的组合确定[26]。常规的酶和化学方法存在长链多不饱和脂肪酸对某些脂肪酶催化分析的抗性[27]、通过格式化学降解可能引起的酰基迁移[28]、样品制备期间的损失或污染等缺点[29]。脂肪酸的核磁共振分析通常使用1H-NMR，但1H-NMR不能对脂肪酸进行位置特异性分析。13C-NMR的化学位移范围(约200 ppm)较大，可以识别几乎所有不饱和脂肪酸，而且可以通过特征化学位移区分不饱和脂肪酸的位置特异性，还可以避免甘油三酯的酶促和格氏水解中无法完全消除酰基迁移所引起的样品损失或污染等问题。因此，定量核磁共振碳谱(13C- qNMR)在分析食用油中不同位置脂肪酸时具有明显优势。

　　目前，13C-qNMR已被用于天然产物[30]和代谢物[31]的定量分析、材料科学[32]和脂质分析[33]等领域。甘油三酯骨架上的羰基碳是13C-qNMR的主要研究对象。然而，羰基碳自旋-晶格弛豫时间(T1)比其它类型的碳更长，而且脉冲角度、脉冲序列以及温度等实验参数对区域特异性分析影响较大，导致每次NMR实验时间较长[34]。这对于在较短的实验时间内实现最佳信噪比(S/N)，进而进行准确的区域特异性分析提出了挑战。为缩短实验时间，Vlahov等[35]假设所有羰基碳受质子去耦的影响相同，在完全核Overhauser增强(NOE)下可获得信噪比较高的谱图。Suárez等[36]将宽带去耦脉冲序列应用于qNMR碳谱分析。然而，Gouk等[34]的研究表明，在sn-1，3和sn-2处的羰基碳的NOE可能不同，因此，宽带去耦脉冲序列并不能用于qNMR碳谱分析中。除了羰基碳，甘油三酯的sn-1，3和sn-2位的其它碳原子也具有不同的化学位移，如乙烯基碳。Meusel等[37]将GC、MALDI-TOF-MS和DEPT-45结合，通过分析乙烯基碳确定食用油中甘油三酯的含量。Merchak等[38]使用13C-INEPT序列(极化转移技术)和气相色谱(GC)分析橄榄油样品中脂肪酸和角鲨烯，同时用13C-INEPT光谱的去卷积峰面积作为预测因子构建多变量预测模型。相对复杂的HSQC-TOCSY NMR谱也已被用于分析甘油三酯混合物中棕榈酸和油酸的位置特异性分布[39]。通常，13C-NMR谱中的峰强度与碳核的数目不成正比，原因是每个碳原子的自旋-晶格弛豫时间不同，以及核的Overhauser增强(NOE)效应不同。然而，采用加顺磁弛豫试剂和加大脉冲间隔，特别是可以采用反转门控去耦消除NOE效应，同时消除全部质子的耦合，可以达到 13C核定量分析的目的[40]。脉冲傅里叶变换NMR的门控去偶(Gated decoupling)取13C的脉冲时间间隔tR> 5T1(T1为该化合物各碳原子中的最长纵向弛豫时间)，这样可使磁化矢量恢复到平衡值，全去耦的碳谱NOE影响很小，谱线高度正比于碳原子数目，可用于定量分析。

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文章名称： 定量核磁共振碳谱同时测定食用油中甘油三酯的sn-1,3和sn-2脂肪酸含量

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