兰州百合试管小鳞茎膨大及碳水化合物变化规律研究

　　摘要：为了探明兰州百合小鳞茎的生长及膨大规律，以添加不同浓度蔗糖处理为依据，明确小鳞茎生根膨大培养基以1/2MS+0.2 mg/L NAA +70 g/L蔗糖为最适。在此浓度基础上对兰州百合试管小鳞芽进行1次和2次膨大培养，分别在培养30、50、70、90 d时测定小鳞茎鲜重、干重、糖及淀粉含量。结果表明，随着培养天数的增加，兰州百合1次和2次膨大小鳞茎单粒鲜重和干重均呈增加趋势，且2次膨大较1次膨大效果显著。1次膨大小鳞茎可溶性糖、果糖和淀粉含量均随培养天数的增加呈先增加后降低的趋势，且变化趋势基本一致;蔗糖含量随着培养天数的增加呈上升趋势，与培养30 d相比，培养50～90 d时蔗糖含量明显增加，且达极显著差异。随培养天数的增加，2次膨大小鳞茎可溶性糖和蔗糖含量变化趋势较平缓，各培养时期差异不明显;果糖含量呈降低趋势，与培养30 d相比，培养50～90 d时果糖含量显著降低;淀粉含量呈增加趋势，在培养90 d时达最大值。

　　关键词：兰州百合;试管小鳞茎;膨大;碳水化合物

　　蘭州百合(Lilium davidii var.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium) 川百合的变种，为多年生鳞茎草本植物，其鳞茎具有营养和滋阴养肺等功效，是我国食用百合中唯一的甜百合。百合在甘肃已有400多年的栽培历史，因其兼具一定的药用价值，被国家卫生部确定为“药食同源”植物，也是甘肃省重要的地理标志产品和重要的名优特农产品之一[1 - 3 ]。长期以来，兰州百合主要以分球繁殖、珠芽和鳞片扦插等无性繁殖方式为 主[4 ]，长期采用易感染病害，造成种性退化，严重影响百合的产量和品质。利用组织培养技术可有效地提高种苗种球繁殖系数，且操作简便，同时还可以保持优良的性状，防止植物病毒的危害，在无性繁殖作物中广泛应用。

　　百合的鳞茎是地下茎及其腋芽肥大而形成的变态器官[5 ]，具有繁殖和营养双重作用，其形成与膨大是个复杂的生理过程[6 ]。碳水化合物的变化与百合鳞茎的发育有着密切的关系[5 ]，其中蔗糖是光合作用的主要产物，存在于许多果实中，它不仅是糖积累的主要方式，更是影响品质形成的重要因子[7 ]。糖既可以直接作为基质调节代谢，也可以作为有效的信号分子，所以糖的可利用性对植物的生长发育有着关键的驱动作用[8 - 9 ]。Jia等[10 ]研究发现，果实的生长和发育与糖浓度变化有着紧密的联系，糖浓度增加时，可诱导ABA的积累，从而加速果实的成熟。淀粉是百合鳞茎细胞内碳水化合物的主要贮藏形式[11 - 14 ]，其代谢作用直接关系到鳞茎及植株的发育[15 - 16 ]。目前关于兰州百合试管小鳞茎形成过程中物质累积、糖及淀粉含量变化规律的研究相对较少，我们利用组织培养技术，采用生长分析法研究小鳞茎生长膨大过程中生物量累积、糖及淀粉含量变化，以进一步了解兰州百合种球的形成及膨大机理，为调控百合鳞茎的生长发育及膨大规律提供技术支撑。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　兰州百合种球于2018年1月在兰州市七里河区西果园镇百合试验田采集，选用外形饱满、颜色洁白、健壮无病虫害的3年生兰州百合鳞茎。试验于2018年3月至2019年12月在甘肃省农业科学院生物技术研究所实验室进行。

　　1.2 试验方法

　　将兰州百合外层鳞片剥去，选取中内层鳞片，用流水冲洗6～8 h，滤纸吸干水分，然后在超净工作台上用无菌水冲洗3～5次，用70%乙醇消毒30～40 s，投入0.1%升汞溶液中消毒8～10 min，再用无菌水冲洗5～6次，置于垫有滤纸的培养皿中晾干水分。用解剖刀将鳞片分上中下3部分，切成0.5 cm×0.5 cm左右的外植体，接种于芽诱导培养基(MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L+30 g/L蔗糖)中。在(25±2) ℃、2 000～3 000 lx光照12～16 h条件下培养。培养30～35 d 后将诱导出的不定芽切下接种至增殖培养基(MS+1.25 mg/L6-BA+0.2 mg/L+30 g/L)中扩繁，然后将丛生苗分单株切下接种到生根膨大培養基(1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+70 g/L蔗糖)中培养(每瓶装50 mL的培养基)。接种60瓶(其中30瓶进行1次膨大测定用，其余30瓶1次膨大90 d后转接到新的生根膨大培养基中，进行2次膨大培养)，每瓶接种10个小鳞芽，定期(30、50、70、90 d)采集样品(小鳞茎)，用直尺测定根长，采用称重法测定小鳞茎鲜重，采用烘干法测定小鳞茎干重[2 ]。

　　1.3 测定方法

　　1.3.1 可溶性糖含量测定 采用蒽酮比色法测定[17 ]。准确吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL浓度为200 μg/mL 的蔗糖标准溶液于7 支刻度试管中，加蒸馏水至2.0 mL，依次加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯试液、5 mL 浓硫酸，经涡旋振荡后，置沸水浴中逐管准确保温1 min，取出并自然冷却至室温后，以空白为对照，测定其在630 nm 处的吸光值，以蔗糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲，并求出标准曲线方程。

　　称取烘干的百合鳞片粉末0.2 g，放入刻度试管中，加入10 mL蒸馏水，沸水中提取30 min，提取液用漏斗过滤(反复漂洗残渣)，上清液最终定容至25 mL的容量瓶中即为可溶性糖提取液，每处理重复提取3次。吸取样品提取液0.5 mL，加入1.5 mL H2O、0.5 mL的蒽酮，再缓慢加入5 mL浓H2SO4，盖上试管塞后轻轻摇匀，然后打开试管塞置沸水浴中煮沸1 min，取出冷却至室温，在630 nm下测OD值，以0浓度管调零。查标准曲线得到提取液可溶性糖含量，计算样品中的可溶性糖含量。

　　1.3.2 蔗糖含量测定 参照张志良[18 ]的方法测定。取蔗糖标准液用80%乙醇稀释成0、10、20、30、40、60、80、100 μg/mL浓度的溶液，分别取0.4 mL溶液，各加入200 μL的浓度为2 mol/L NaOH溶液，100 ℃煮沸5 min，冷却，再加入2.8 mL 30% HCl和0.8 mL 0.1%间苯二酚，摇匀，80 ℃水浴10 min，冷却后在480 nm下测定OD值，以0浓度管调零。以蔗糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲，并求出标准曲线方程。

　　称取烘干的百合鳞片粉末50 mg，放入10 mL刻度离心管中，加入4 mL 80%乙醇，置于80 ℃水浴中不断搅拌40 min，离心，收集上清液，其残渣加2 mL 80%乙醇重复提2次，合并上清液。在上清液中加入10 mg活性炭，80 ℃脱色30 min，80%乙醇定容至10 mL，重复3次。吸取样品提取液0.4 mL，加入2.8 mL 30%HCl和0.8 mL 0.1%间苯二酚，然后摇匀，80 ℃水浴反应10 min，冷却至室温，在480 nm下测定OD值，以0浓度管调零。查标准曲线得提取液中总的蔗糖含量，计算样品中的蔗糖含量。

　　1.3.3 果糖含量测定 称取标准果糖溶液用80%乙醇稀释成浓度0、15、30、50、75、150、200 mg/mL的溶液，取小试管8支，分别加入1.0 mL不同质量浓度的标准果糖溶液，各加入2.0 mL 0.1%间苯二酚及1.0 mL H2O，摇匀。80 ℃水浴反应10 min，冷却至室温，用分光光度计在480 nm处测定光密度OD值，以0浓度管调零。以果糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲，并求出标准曲线方程。

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文章名称： 兰州百合试管小鳞茎膨大及碳水化合物变化规律研究

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