来源:期刊VIP网所属分类:化工生产发布时间:2020-12-22浏览:次
摘 要 核酸适配体(简称适配体)是一类重要的“化学抗体”型功能性生物分子,基于适配体的质谱技术在提供分子质量及结构特征等基础上,兼具了针对靶分子的高选择性及亲和富集特点,从而提供出高特异、高灵敏信息。本文综述了近年来适配体在质谱分析中的应用进展,重点评述了适配体在质谱分子相互作用表征中的应用、适配体作为离线型和在线亲和材料用于质谱分析测定等现状,其中结合多种质谱新技术, 通过创建或结合多种前处理或在线一体化信号增强方式,特别是适配体功能化纳米材料的应用,在相互作用表征、痕量靶分子选择性提取和高灵敏检测等质谱分析测定方面是研究的重点。最后,本文对适配体在质谱研究中的应用前景进行了展望。
关键词 适配体; 质谱; 相互作用表征; 纳米材料; 功能化; 评述
1 引 言
适配体是通过指数富集配体系统进化技术体外筛选得到的单链寡核苷酸序列,如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)序列,能特异性识别靶分子,如小分子、生物大分子(蛋白质、酶、毒素、转录因子等)、病原体(病毒、细菌、细胞)、组织等,具有体积较小、结构灵活、变性复性快速可逆、易功能化修饰与标记、自身稳定性强和无免疫原性等优点[1]。适配体已在分析化学、药学、生物医学等多个领域得到应用,例如生物传感技术、DNA纳米技术、即时诊断、药物靶向递送等[2]。近年来,适配体作为亲和分子,已出现酶联适配体吸附剂、适配体型固定相、阵列式芯片、酶微反应器等多种形式,继而结合生物传感器、色谱、质谱(MS)等进行分析检测。
核酸适配体在质谱中的应用研究可分为两类模式: 一类是针对所形成靶分子-适配体复合物的天然结构进行质谱表征; 另一类是利用亲和材料,由生物相容性载体(如磁珠、树脂、纳米粒子等,负载适配体亲和分子)对分析物靶分子进行特异性提取、富集和净化,再对所捕获到的分析物进行质谱分析。适配体可作为离线前处理式亲和材料,需要采取合适的洗脱方式洗脱相对纯净的分析物,再进行质谱鉴定或液相色谱-质谱定量分析; 或直接用于在线亲和捕获富集和质谱靶向鉴定/测定“一体化”分析。
2 适配体在质谱分子相互作用表征中的应用
尽管已产生了具有高亲和力和选择性的多种靶分子的适配体,但缺乏高分辨率的结构数据以及当前各种生物物理表征方法的局限性等因素极大地阻碍了对适配体-靶分子相互作用机理的研究。质谱技术,特别是高分辨质谱技术,是靶分子-适配体相互作用表征的有力工具,可提供复合物分子量、结合比、选择性以及相互作用位点解析等多种信息。但是, 当适配体作为相互作用分子之一时,难点在于包括寡核苷酸在内的生物大分子电离效率低、相互作用结合位点解析困难,相互作用结构易受周围环境影响等,优点在于可以创造环境保持靶分子-适配体复合物的天然构象、特异性强、免标记、检测快速、样品量低、高通量等。基质辅助激光解吸电离-质谱技术(MALDI-MS)和液相色谱-电喷雾电离串联质谱技术(LC-ESI-MS/MS)是其中的代表性技术,交联结合质谱(XL-MS)、非变性质谱(Native MS)、氢/氘交换质谱(HDX MS)、自上而下质谱(Top-Down MS)、离子淌度联用质谱(IMS-MS)等工具则为之注入了新的活力。
引入化学交联方法,可精确绘制相互作用位点图谱。1999年,Golden等[3]首次利用ESI-MS鉴定了碱性成纤维生长因子155(bFGF155)与其内嵌5-溴-2-脱氧尿嘧啶(BrdU)的61 mer 适配体复合物,分别使用胰蛋白酶酶解、蛇毒磷酸二酯酶/碱性磷酸酶酶解,结合碰撞诱导电离(CID),确定出结合位点为bFGF155的一条九肽TGQY133KLGSK与61 mer适配体中的一个二聚核苷酸等。2017年,Lu等[4]结合XL-MS,设计了一种新颖的多功能化学探针,其结构中含有组蛋白H4的适配体序列、生物素标签、用于光交联的芳基叠氮光敏基团,以及使适配体与组蛋白易于解离的二硫键,实现了组蛋白H4的选择性标记和高效富集,并首次揭示出组蛋白H4与其适配体的结合区域处于N-末端尾部。
对非共价复合物可以直接进行质谱表征,无需化学交联。2005年,Keller等[5]报道了小分子(如妥布霉素、三磷酸腺苷(ATP)和核黄素等)与各自适配体在ESI-MS中的识别行为,发现氢键、π-π堆积对相互作用起到主要作用,但某些高亲和性适配体在气态电离时因为高库仑斥力而导致稳定性下降。2018年, Gulbakan等[6]首次使用非变性ESI-IMS-MS,提供了大量关于小分子(如腺苷、L-精氨酰胺、可卡因等)与适配体相互作用的基础信息(图1),发现电荷状态与适配体寡阴离子构象间的相关性,提示适配体-小分子相互作用在较低电荷态的复合物离子中得到更好保留,而较高电荷态的复合物离子在气相中更易解离,并揭示了化学计量结合比、结合特异性、小分子选择性以及适配体-小分子结合中的协同作用等。
2013年,Chen等[7]首次报道了蛋白质-适配体复合物在MALDI-MS中的成功表征,仅需低样品量(1 pmol)和小体积(1~10 μL),使用非酸性基質6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT),可观察到凝血酶-凝血酶适配体(TBA)15/TBA29、血小板衍生生长因子-AB/BB及其适配体的非共价复合物峰,并可用于亲和力高低排序。2014年,Trelle等[8]利用HDX-MS研究了RNA适配体对靶蛋白-纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)的构象影响。PAI-1存在从活性构象到无活性构象(潜在状态)的过渡,此种过渡是折叠的蛋白质结构域未被共价修饰时可发生的最大的构象变化之一。研究发现,加入RNA适配体使RAI-1摄取氘的速率明显下降,活性构象得以稳定,进一步证实了适配体结合区域属于过渡态的结构不稳定区域(图2)。
非变性质谱是揭示结合比和推测结合位点的有力工具。2017年,Zhang等[9]通过高分辨傅立叶变换离子回旋共振(FTICR-MS)及四极杆-飞行时间串联质谱(QTOF-MS/MS)表征了凝血酶-TBA复合物。凝血酶和TBA15结合比受溶液离子强度影响,20~200 mmol/L NH4Ac存在时,凝血酶-TBA复合物呈1∶2型到1∶1型的变化,反映了该相互作用受静电作用调控的特性,进一步根据电子捕获电离(ECD)-MS推断出凝血酶和TBA间的可能结合位点为其纤维蛋白原结合位点,与晶体学数据一致。
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文章名称: 核酸适配体在质谱中的应用与展望
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