电生理膜片钳相关设备使用规范

　　【关键词】膜片钳系统;微电极拉制仪;仪器设备;使用规范

　　一、膜片钳技术的工作原理

　　膜片钳技术是用于了解离子通道行为的通用型电生理工具，首先用微玻管电极(膜片电极或膜片吸管)接触细胞膜，然后以千兆欧姆以上的阻抗使电极尖端与细胞膜封接，通过吸破或者电破的方式使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域与其周围区域在电学上分隔，然后细胞膜破裂，进而对此区域上的离子通道的离子电流进行监测记录的方法。该方法广泛应用于神经细胞，肌纤维细胞，心肌细胞及高表达单一通道的卵母细胞。主要用于监测离子通道在正常或者疾病状态下如何表现，以及不同药物、离子或其他分析物如何改变这些状态。

　　膜片钳技术的建立，对生物科学特别是神经科学是一项具有重大意义的变革。这是一种通过离子通道记录的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个)的离子通道活动的技术。该技术的出现将生理学的细胞水平和分子水平联系在一起，又将神经科学的不同亚科融汇在一起，促进了各个学科之间的联系，加速了我们神经科学的研究进展，深入探讨神经活动的机制研究。

　　二、膜片钳技术操作方法

　　实验前准备：打开总电源及稳压电源，打开电脑、放大器，并开启程序软件patchmaster，新建数据文档并准备开始试验;用P97微电极拉制仪拉制玻璃电极若干备用;检查减震台的减震效果，打开倒置显微镜，监视器和微操备用;取一皿细胞将其中玻片取出放入小培养皿中，置于倒置显微镜下，于低倍镜下寻找状态良好的细胞，并转入高倍镜下再次确认细胞状态及贴壁情况等;确认细胞后，取电极一根充灌电极内液，弹出气泡，然后套入银丝并插入探头中扭紧旋钮，用注射器管道给电极一点点正压，将电极入水;入水后，查案入水电阻，要在4-8M左右的电极才可以使用，通过调节微操，使电极不断向下接近细胞，待电极尖端逐渐变清晰并且将要接近细胞时停止向下，然后把电极移到细胞上方，调节放大器上的调零旋钮以保证基线在零水平。

　　开始封接：调低微操步进速度，使电极尖端慢慢向细胞靠近，如发现基线方波突然变小，封接电阻上升时，即停止电极下降，通过注射器给电极负压，封接成功的可见方波很快变小，电阻升至G欧。此时，调节快电容补偿按钮，将快电容电流补偿掉，如封接稳定后，准备破膜。

　　破膜：在钳制电位水平- 60mV时，漏电流<20pA，给予比较大的负压(也可根据情况使用ZAP电破方式破膜)，将要破膜时可见基线上下浮动，破膜后，可见基线前后有两个较大的慢电容电流。此时需要观察操作程序上漏电流数值，如果超过50pA，表明漏电流很大，此细胞不能继续实验。如漏电流正常(小于20pA)则继续以下实验：调节慢电容(c-slow)与快电容(c-fast)补偿按钮，将慢电容电流也补偿掉。同时观察破膜电阻Rm(正常500M-1G)、串联电阻Ra(正常5M-15M)，记录膜电容值。设置滤波频率为3.9KHz，采样频率为25-50KHz，要求漏电流小于20pA。

　　电压钳模式记录：在全细胞记录模式( whole-cell)下，为了让电极内液和细胞内液充分交换，以达到稳定细胞状态的目的，我们需要静待几分钟。细胞稳定后，在电压钳的模式下，给予- 60mV-60mV的电压刺激，便可观察到细胞总的内向和外向电流，结合内向和外向流的大小，就可初步判断细胞的兴奋水平，判断细胞状态、封接的好与坏、电容补偿是否符合要求。

　　电流钳模式记录：将记录模式转换到电流钳模式( c-lamp)下，把钳制电流数值改为“0”，可在程序软件上观察到静息膜电位数值( Resting Membrane Potential，RP)，记录膜电位数值大小，正常神经细胞静息膜电位在50-60V。记录动作电位：神经损伤、炎症下或者神经增敏下，初级感觉神经元的兴奋性会发生改变，一般采用300ms波宽标准记录参数。

　　神经元兴奋性记录：神经元的兴奋性主要是通过描述神经元的细胞膜特性表示。神经元细胞的膜特性包括主动膜特性和被动膜特性。主动膜特性包括动作电位阈值(阈电位)、振幅、持续时间、超射、潜伏期、基强度以及在2倍和3倍基强度电流刺激产生的动作电位的数量;被动膜特性包括膜静息电位、输入阻抗和膜电容等。

　　三、注意事项

　　首先操作过程中如有转移液体的，应注意把物镜调节，不要将溶液溅到显微镜头;不可用手直接接触探头银丝，会损害放大器;实验前观察探头银丝的镀银情况，如银丝表面已发白，则需镀银;地线需要浸没在液体以下，确保实验正常开展。

　　四、日常清洁维护

　　实验结束及时关闭放大器，延长放大器寿命;把显微镜光源调至最小后关闭显微镜电源;微操的步进马达关闭之前一定要归零;保存好所有数据后，关闭软件和电脑;如实验中用到加药管，需要用超纯水清洗加药管与吸水管，否则管道将会被盐溶液结晶后堵塞。将废液缸中的液体倒掉，垃圾带走，使用完毕的玻璃电极，扔进锐器盒;将自己的东西全部收拾好，放回原位;打扫膜片钳室，以保证实验室的清洁;膜片钳室需要配备除湿机，加强房间干燥，防止设备受潮;房间注意防尘，尽量不长时间开窗，保障设备干净整洁。

　　五、可能常见问题

　　膜片钳实验，最棘手的就是排干扰的问题：要防干扰，需要给所有设备设置屏蔽笼和机柜，可以有效地排除外界干扰;还要将屏蔽室内外的各个可能产生电磁干扰的仪器务必都要接地，有的仪器有很多零部件，有些部件之间是绝缘的，要将绝缘的部分分别接地。同一个部件不要重复接地，否则也可能产生干扰。显微镜是膜片钳实验中很重要的一个组成部分，所以它的排干扰问题也非常重要，我们需要把显微镜的灯罩打开，在内部的螺丝上接出一根线，然后在显微镜臂上的螺丝上接一根线，可以有效的排除干扰;另外浴槽电极与灌流液一定要接触良好，不然也会出现干扰的。接地线没有特殊的要求，只要一般的电线就可以了，实验过程中，要防止所有实验液体流到实验台或者防震台上，否则也会产生干扰。排除干扰，是我们正常开展上机实验的前提，至关重要。

　　我们实验中可能还会出现放大器超载现象，关于这个问题，我们可以从以下几个方面检修：(1)查看电极拉制质量，保证电极没有断头、过粗的现象;(2)检查放大器探头和参比电极的银丝镀银情况，要经常镀银，并且要保持镀银均匀;(3)检查各个设备接地良好;(4)实验用细胞外液、电极内液按照规定配方规范配置，液体渗透压、pH保证在正常范围，并用滤膜过滤去除杂质细菌;(5)电权入水后适当调节液接电位。

　　六、膜片钳附属设备：P-97微电极拉制仪

　　P-97微电极拉制仪是用于Flaming/Brown型微电极、膜片钳电极、微注射针的拉制器。简单阐述一下电极拉制过程：打开拉制仪开关，选择已经设置好参数的拉制通道，选择enter键进入。拿取一根玻璃电极，沿弹簧夹上固定玻璃电极的位置向加热室推进，并小心准确地將玻璃电极在加热室的铂金片中穿过，推到底后，用手固定下面的一侧的固定夹把手，旋紧该固定夹旋紧螺母，另一只手推动另外一侧固定夹，两侧固定夹紧靠加热室两侧，确保加热室两侧玻璃管长度对称，旋紧另一侧固定夹螺母。盖好拉制仪盖子，摁PULL按钮，然后拉制仪即开始加热拉制程序。拉制仪启动加热，加热到指定HEAT值，铂金片开始变红发热，玻璃管开始融化，伴随着两侧固定臂的拉力，当拉力达到设定的VEL值，铂金片停止加热，并开始吹气冷却，吹气的压力和时间即为设定的pressure和TIME，在两臂的持续拉力下，拉开电极。即完成了一次拉制。

　　使用拉制仪需要注意以下几点：首先安放加热片要在吹气孔的正中间，不能和微玻璃管有任何接触，若加热片安装的位置不准确，对电极的准确拉制影响很大。拉制电极都需要先通过RAMP TEST确定HEAT值，再不断调整PULL、VEL、TIME值，参数要慢慢调试，才可以满足实验需要。平时要做好设备的防尘工作，避免触碰加热片，定期进行干燥剂更换。

　　电生理膜片钳设备价格昂贵，设备使用和维护要求也比较高，因此实验人员务必掌握规范的操作要领，严格遵守使用规范，并定期做好设备的清洁维护，才可以保证设备的有效运行以及科研成果的准确性和稳定性。

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