维生素吡咯喹啉醌对水芹种子萌发的生理效应

　　摘要：研究了不同质量浓度(4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL)的吡咯喹啉醌(PQQ)对水芹种子萌发过程的影响，结果表明：在PQQ的作用下，水芹种子的发芽率、发芽势、发芽指数和呼吸强度均随着PQQ质量浓度的增加而提高，其中质量浓度为16 μg/mL的PQQ浸种效果最佳，PQQ具有促进水芹种子萌发的生理效应;PQQ的作用对水芹种子中淀粉酶活力影响不大，对脂肪酶和过氧化物酶活力有着明显的增强作用.

　　关键词：吡咯喹啉醌;水芹;种子萌发;生理效应

　　《工程与试验》(季刊)创刊于1961年，由中国仪器仪表学会试验机分会、长春试验机所主办。本刊秉承“宣传贯彻科学技术是第一生产力的思想，介绍新的科技成果，传播新的科技信息，普及科学知识、科学方法和科学思想，促进生产力的发展”的办刊宗旨;奉行“科学、严谨、务实、求真”的办刊方针。

　　0 引言

　　1960年代，一种新型维生素吡咯喹啉醌PQQ(pyrroloquinoline quinone)被科学家发现，它广泛存在于水果、蔬菜、谷物等食品中，是許多细菌中甲醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶GDH(glucosedehydrogenase)、甘油脱氢酶等的辅酶，能够参与呼吸链电子传递[1-2].但是，只有部分革兰氏阴性菌能够自身合成PQQ，而人类与动植物主要从外界获取该维生素[3-4].

　　研究表明，PQQ可以缩短植物生长停滞期，促进植物细胞新陈代谢和生长[5].

　　张鹏等[6]研究发现，在小麦植株生理代谢调节过程中，PQQ可增加叶绿素含量，使光合速率增加，并提高硝酸还原酶和谷氨转氨酶活性，从而减少穗部小花败育，提高小麦结实率.

　　匡炜等[7]的研究表明，PQQ能有效提高湘早籼45号水稻的每穗实粒数和结实率，减少每穗空粒数，对水稻增产有促进作用.另外，PQQ作为GDH

　　的氧化还原辅因子，可将葡萄糖转化为葡萄糖酸，溶解不溶性磷酸盐到土壤中，促进植物吸收生长[8].PQQ还可以促进玫瑰红苹果和红富士苹果花粉萌发和花粉管生长，但浓度过高则会减弱效果，甚至产生抑制效应，且红富士苹果较玫瑰红苹果更为敏感，当PQQ浓度高于1 μmol/L时即产生明显的抑制效应[9].

　　总之，PQQ能促进某些植物生长，但其对水芹种子的萌发过程是否有影响尚不明确.本文拟以水芹种子为原料，研究不同质量浓度的PQQ对水芹种子萌发的影响，并进一步研究PQQ的作用对种子萌发过程中关键酶(淀粉酶、脂肪酶和过氧化物酶)活性的影响，以明晰PQQ对水芹种子萌发的生理效应和作用机制.

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　实验材料：水芹种子，购于郑州市种子公司;吡咯喹啉醌(色谱纯)，由瀚香生物科技公司提供.

　　实验试剂：3，5-二硝基水杨酸、甲苯、乙醇，天津市致远化学试剂有限公司产;愈创木酚，北京索莱宝科技有限公司产;橄榄油、乙醚，生工生物工程上海股份有限公司产;百里香酚酞，广东光华化学厂有限公司产.以上试剂均为分析纯.

　　1.2 仪器与设备

　　HH-S型数显恒温水浴锅，江苏省金坛市医疗器械有限公司产;SHP-250型恒温光照培养箱，上海鸿都电子科技有限公司产;2300型UV-分光光度计，尤尼克(上海)有限公司产;Sartorius PB-10型pH酸度计，上海市实验仪器总厂产.

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 水芹种子萌发

　　取大小均匀的水芹种子，将其分为5组，每组20粒.用质量分数1%的NaClO浸种20 min，蒸馏水洗净，再用不同质量浓度的PQQ(4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL)室温浸种48 h，用3 mL不同质量浓度的PQQ溶液浸润滤纸，并将种子点播吸附在滤纸上，置于恒温培养箱中于25 ℃下光照培养.其间补加相应质量浓度的PQQ以保持滤纸的湿润[10].实验持续5 d，每d记录正常发芽种子数.按以下公式计算水芹种子的各种活力指标.

　　发芽率=种子发芽数供实验种子数×100%

　　1.3.2 呼吸强度测定

　　呼吸强度，是植物体新陈代谢强弱的一个重要指标，它是指单位面积或单位质量的植物体，在单位时间内所吸收的O2或释放的CO2量或损失的干重.

　　用饱和碱液吸收一定量的植物材料在单位时间内放出的CO2，再用标准酸液滴定，即能测得植物的呼吸强度.

　　参照李海霞等[11]的方法，用上述不同质量浓度的PQQ对种子进行浸种处理，实验持续 5 d，每d对呼吸速率进行测定，然后按以下公式计算呼吸强度.

　　其中，V0为空白滴定用去的草酸量/mL，V1为样品滴定用去的草酸量/mL，W为样品鲜重/g，T为测定时间/h.

　　1.3.3 酶活力测定

　　1.3.3.1 淀粉酶活力测定

　　参照张志鹏[12]的方法，采用3，5-二硝基水杨酸还原法，每12 h对不同质量浓度PQQ浸种处理的水芹种子中淀粉酶活性进行测定，实验持续3 d。酶活力定义为每g样品在单位时间内生成还原糖(麦芽糖)的量.

　　麦芽糖标准曲线的制作：分别配制0 mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL 和1.0 mg/mL的麦芽糖标准溶液，吸取标准溶液1.0 mL于刻度试管中，加3.0 mL 二硝基水杨酸(DNS)试剂，摇匀，沸水浴10 min后经流水冷却，加蒸馏水定容至15 mL，在520 nm 的波长下比色测定吸光度值，并建立通过吸光度值求麦芽糖质量浓度的回归方程.

　　淀粉酶液制备：称取1 g经不同质量浓度PQQ溶液作用的水芹种子于研钵中，加入5 mL蒸馏水，研磨匀浆后倒入离心管中，再用10 mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管.在室温下静置 20 min 制备提取液，每隔5 min搅动1次，使其充分提取.在4 ℃条件下3000 r/min低温离心10 min，取上清液加蒸馏水定容至100 mL后摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定.取淀粉酶原液10 mL，用蒸馏水定容至 50 mL 后摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶活力的测定.

　　1.3.3.2 脂肪酶活力测定

　　脂肪酶可以分解种子中贮藏的营养物质，为种子萌发的异养阶段提供能量[13].

　　参照GB/T 5523—2008[14]，称取2 g水芹种子于研钵中，加入1.0 mL橄榄油，混匀，加入5.0 mL pH=7.5的磷酸缓冲液，研磨后转入100 mL锥形瓶中，用5.0 mL蒸馏水洗净研钵，洗液全部转入锥形瓶中，加3滴甲苯，置于30 ℃恒温箱内，保温24 h后取出.加入V(乙醇)GA6FAV(乙醚)=4GA6FA1的混合液50 mL，静置5 min，加入0.5 mL质量分数为1%的百里香酚酞乙醇溶液指示剂，用0.2 mol/L氢氧化钠乙醇溶液滴定至终点(浅蓝色)，记录用去碱液的体积(V2).另外称取2 g相应质量浓度试样做对照试验，除不用 30 ℃ 保温24 h外，其余操作同上，记下用去的碱液体积(V3).

　　每12 h对不同质量浓度PQQ作用的水芹种子进行脂肪酶活性测定，实验持续 3 d.

　　其中，V2为试样滴定用去的碱液体积/mL，V3为对照试验用去的碱液体积/mL，N为实际碱液质量浓度/(mol·L-1)，W1为试样质量/g，M为试样水分质量分数/%.

　　1.3.3.3 过氧化物酶活力测定

　　过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，与呼吸作用、光合作用、生长素的氧化等都有关系[15].

　　分别取0.5 g经不同质量浓度PQQ作用的水芹种子于研钵中，加入液氮后充分研磨，再加入3.0 mL磷酸缓冲液，预冷5 min，7000 r/min 离心15 min，上清液为粗酶提取液，提取后低温保存待用.

　　酶活力测定的反应体系为：0.05 mol/L磷酸缓冲液2.9 mL;2%的H2O2 1.0 mL;0.05 mol/L 愈创木酚 1.0 mL;酶液0.1 mL.用加热煮沸5 min的酶液作为对照.反应体系加入酶液后，立即于34 ℃水浴保温30 s，在 470 nm 波长处进行比色，开始记录数据，然后每 0.5 min 记录一次吸光度值，共测2 min.

　　以每min A470的变化值0.01为一个相对酶活单位U，计算植物组织内过氧化物酶活力的大小.每12 h对经不同质量浓度PQQ作用的水芹种子进行过氧化物酶活力测定，实验持续3 d.

　　其中，Vt为酶液的总体积/mL，ΔA470为吸光度的变化值，t为间隔时间/min，Vs为测定时取用的酶液体积/mL，W2为粒种子的质量/g.

　　2 结果与分析

　　2.1 不同质量浓度的PQQ对水芹种子萌发的影响

　　水芹种子萌发实验结果如图1所示.由图1可知，以胚根突破种皮1 mm作为种子发芽标准(图1a))，萌发初期(即培养期的前96 h)组间差异不明显，水芹种子基本不发芽或者刚刚露白(图1b)).图2为中后期水芹种子萌发情况.由图2可知，在4种质量浓度范围内，PQQ质量浓度越高，对种子萌发的促进作用越明顯.在质量浓度为16 μg/mL的PQQ作用下，种子萌发到120 h时的发芽率为43.4%，对照组发芽率为33%;至192 h时的发芽率提升至85%，对照组发芽率为42.6%.在其他3种质量浓度的PQQ作用下的水芹种子的发芽率均高于对照组，低于在质量浓度为16 μg/mL的PQQ作用下的发芽率.由此可见PQQ能有效促进水芹种子的萌发.

　　在不同质量浓度的PQQ作用下水芹种子的发芽指数、发芽率和发芽势如图3和图4所示.由图3和图4可知，水芹种子在萌发的第 8 d，对照组的发芽率为56.7%，在质量浓度为 8 μg/mL 的PQQ作用下的种子发芽率为70%;在质量浓度为16 μg/mL的PQQ作用下的种子发芽率最高，为86.7%.以萌发第5 d计算发芽势，在质量浓度为0～16 μg/mL的PQQ作用下，种子的发芽势从33.3%提高到43.3%.这表明随着PQQ质量浓度的提高，水芹种子发芽势逐渐增大，种子活力提高，发芽率随之提高.

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文章名称： 维生素吡咯喹啉醌对水芹种子萌发的生理效应

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