常见金属离子对过氧化氢酶生物合成的影响

　　摘 要：过氧化氢酶是生物体内的一种末端氧化酶，可以减轻甚至清除过氧化氢在体内聚积对机体造成的损伤，调控过氧化氢酶的生物合成对机体具有十分重要的意义。通过在黑曲霉发酵培养过程中分别加入不同的金属离子，培养结束后进行细胞破壁，提取过氧化氢酶，检测不同金属离子对过氧化氢酶活力的影响。结果表明：在发酵培养的24h阶段，增加CaCO3添加量，同时减少Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-+等离子的含量，既可提高菌体的生长速度，又可提高过氧化氢酶的产量。

　　关键词：过氧化氢酶;金属离子;生物合成;影响

　　过氧化氢酶(CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的末端氧化酶，能催化细胞内过氧化氢分解，防止过氧化物的形成，从而使细胞免于遭受过氧化氢的毒害。在人体正常生理条件下，过氧化氢酶可催化过氧化氢的快速分解，使H2O2失去活性氧的作用，且效果十分显著。过氧化氢酶还被广泛应用于面包和饮料的生产中，因其能分解H2O2产生O2和H2O的性质，可将过氧化氢酶和过氧化氢共同作为烘烤食品的膨胀剂。过氧化氢酶在对牛奶饮料等的消毒上应用更为广泛。研究表明，利用过氧化氢酶降解工业废水中过氧化氢，不仅可以避免对环境造成二次污染，同时对芳香和脂肪烃化合物进行降解也相当有效。过氧化氢酶价格低廉且化学性质稳定，已在很多含酚废水的污水处理中得到广泛应用。在纺织生产过程中，过氧化氢酶还可快速安全地清除H2O2，既减少了染色布磨损，又有利于保护环境。过氧化氢酶还被广泛应用于工业酶催化中，降低工业酶催化过程中产生的副产物的积累或酶发生降解等不良影响。Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+等是人体必需的生命元素，研究这些离子对过氧化氢酶稳定性和酶活性的干扰具有生物学和医学意义。为此，笔者利用黑曲霉在不同离子作用的条件下发酵产生过氧化氢酶，测定酶活力，探讨不同离子对过氧化氢酶生物合成的影响，以期通过控制离子含量来提高过氧化氢酶活性，进而降低过氧化氫对机体造成的损害。

　　1 材料与方法

　　1.1 培养基制备 霉菌分离培养基(马丁氏培养基)：K2HPO4 1g、MgSO4·7H2O 0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15～20g、水1000mL、1%孟加拉红水溶液3.3mL，无菌操作时加1%的链霉素使其终浓度为30μg/mL。发酵培养基：5% 葡萄糖、0.012% MgSO4、0.2% KCl、0.015% KH2PO4、0.06% NH4H2PO4、0.2%蛋白胨、0.3%牛肉膏。

　　1.2 菌种筛选 取适量土样置于装有无菌水的锥形瓶中搅拌，使采集的泥土分散成均匀的土壤悬液，将涂布好样品的平板放在恒温培养箱中培养，培养箱温度28℃，倒置培养2～3d。

　　1.3 菌种发酵培养 接种筛选出的黑曲霉纯培养物的种子液，30℃条件下摇床，转速为160rpm。将得到的种子液接种于含15%葡萄糖的发酵培养液，接种量为10%(w/w)，温度32℃，pH自然，摇床培养，培养时间48h。

　　1.4 过氧化氢酶活性测定 对发酵液进行过滤，离心后用缓冲液清洗沉淀，得到菌体细胞;将所得细胞用细胞破碎仪进行破壁，细胞破碎仪功率为80W，超声3s，共操作180～200次，每次间隔3s;细胞破壁工作结束后进行离心操作，4000rpm/min，持续10min，取上层液体作为酶液，用紫外分光光度法测定其酶活力。酶活力的测定标准曲线制作：取6只小试管并分别编号，按表1所示依次加入对应试剂，然后振荡试管摇匀，在350nm处以0号管调零，继而分别测定另外5只试管的吸光度。样品检测：依次加入1.5mL缓冲溶液、0.1mL酶提取液、1.2mL蒸馏水，然后加入0.2mL过氧化氢溶液，立刻计时4min后加入1mL硫酸终止反应，测定350nm吸收值。分别测定几种金属离子存在的条件下，黑曲霉培养24h及48h产过氧化氢酶的活力，计算方法如下：

　　[E=aAK-AS+bwt×250.1] (1)

　　式中：AK为对照样吸光度;AS为样品吸光度;wt为反应时间;a、b为标准曲线参数。

　　1.5 菌体干重測定 取10mL发酵液，放在烘干且达到衡重的滤纸上进行过滤，为使不溶的碳酸盐溶解，加入2mol/L HCL使其转变为可溶的氯化盐，然后用蒸馏水冲洗。将收集的滤液用细菌滤器再过滤，最后将吸附有菌体的过滤器在烘箱(100℃)内干燥4h称重。分别测定几种金属离子存在的条件下，培养24h及48h的黑曲霉菌体重量。

　　2 结果与分析

　　2.1 过氧化氢酶标准曲线 由图1可知，标准曲线的方程为y=1.215x+0.0311，截距(a)为0.0311，斜率(b)为1.215，相关系数R2=0.9916。

　　2.2 不同金属离子对菌体生长和条件以及过氧化氢酶的影响

　　2.2.1 pH 由图2可知，培养液中添加了CaCO3能够明显抑制培养基pH下降，添加其他离子的培养液pH也较对照略高，但抑制pH下降的功能不明显。

　　2.2.2 菌体干重 由图3可知，除CaCO3以外，其他金属离子在培养24h后对菌体生长都具有一定的抑制作用，培养时间达到48h后，Cl-、PO43-菌体生长具有小幅促进作用，虽然加入了Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+的培养基中菌体干重依然低于对照，但高于同条件下培养24h的菌体干重，说明Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+对菌体生长依然有抑制作用;而CaCO3在整个培养过程中对菌体生长都有促进作用，加入了CaCO3培养48h后的菌体干重达到22.8mg/mL，这与CaCO3能够抑制pH下降相关。

　　2.2.3 过氧化氢酶活力 由图4可知，培养24h后，对照过氧化氢酶活力为32.4IU，而加入了CaCO3培养24h后的过氧化氢酶活力为112.9IU，明显高于对照。由此可见，CaCO3对菌体生长及过氧化氢酶的酶活力提高均具有明显的促进作用。除了加入ZnCO3的培养基外，其余金属离子培养液中过氧化氢酶活力都高于对照，说明Zn2+对过氧化氢酶活力具有最明显的抑制作用。

　　3 结论与讨论

　　试验结果表明：CaCO3对黑曲霉菌体生长及过氧化氢酶的合成具有促进作用。培养24h时，Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-对黑曲霉菌菌体生长及过氧化氢酶的生物合成具有抑制作用;培养48h时，只有Zn2+对黑曲霉菌菌体生长及过氧化氢酶的合成均具有抑制作用。因此，发酵工业上，在发酵培养的24h阶段，可以通过控制CaCO3加入来提高菌体的生长速度及过氧化氢酶的活力，同时要避免Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Cl-、PO43-等离子的产生;在发酵培养的48h期间，要避免Zn2+的产生，可以有效减轻过氧化氢对发酵的危害，使菌体保持较快的生长速度，也可使过氧化氢酶的活力达到较高水平。

　　参考文献

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