高频彩色多普勒超声在裸鼠前列腺种植肿瘤中的应用

　　【摘要】 目的 探索高频彩色多普勒超声与实际游标卡尺测量肿瘤的相关性。方法 将0.10 mL 2×106 DU145细胞悬液注射到裸鼠前列腺包膜下。细胞注射后第2周至第5周使用高频彩色多普勒超声测量裸鼠肿瘤横径与纵径。麻醉状态下解剖裸鼠，游离肿瘤，游标卡尺测量肿瘤横径与纵径。肿瘤放入1.3 mol?L-1甲醛中固定，HE染色。结果 高频彩色多普勒超声测量的横径与使用游标卡尺测量的横径相比，Pearson与Spearman相关系数分别是0.996(P<0.001)与0.964(P<0.001);高频彩色多普勒超声测量的横径与使用游标卡尺测量的纵径相比，Pearson与Spearman相关系数分别是0.988(P<0.001)与0.898(P<0.01)。结论 高频彩色多普勒超声可精确地监测裸鼠前列腺原位种植肿瘤的生长。

　　【关键词】 高频彩色多普勒超声 原位种植 前列腺肿瘤 动物模型

　　Abstract: Objective To investigate the growth of tumor of dependablity between ultrasonography and vernier caliper.Methods Tumor cell were implanted into capsula prostatica of nude mice with 0.1 mL 2×106 DU145 cell suspensions.And detected the tumor′s transverse diameter and vertical diameter by high frequency color doppler ultrasound in the 2nd,3rd,4th,5th week after injection.The nude mice were dissected under narcotism,and dissociated the tumor,mearsured transverse diameter and vertical diameter of tumor by vernier caliper.Then the tumor was fixed in 1.3 mol?L-1 formaldehyde and stained by HE.Results The result of tumor measured by ultrasonography and vernier caliper had a strong correlation:the coefficient of correlation of Pearson and Spearman were 0.996(P<0.001) and 0.964(P<0.001) in transversal diameter,0.988(P<0.001) and 0.898(P=0.006) in vertical diameter.Conclusion High frequency color doppler ultrasound can monitor the growth of orthotopic prostate tumor of nude mouse punctually.

　　Key words: high frequency color Doppler ultrasound;orthotopic implantation;prostate tumor;animal model

　　当今进行抗肿瘤药物的临床前实验，常使用裸鼠或重症联合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency，SCID)。在其皮下种植肿瘤而建立动物模型，给予抗肿瘤药物干预，并通过游标卡尺测量肿瘤体积的变化，来评价抗肿瘤药物的治疗效果。但是对于前列腺原位种植肿瘤，由于肿瘤生长在腹腔内，位置较深，不可以使用卡尺直接进行体表测量。本研究采用高频彩色多普勒超声对每只裸鼠原位种植肿瘤进行测量，随即解剖裸鼠，显露肿瘤进行卡尺测量，比较超声与实际卡尺测量的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 BALB/C雄性裸鼠,6～8周龄，体质量22～24 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，并在北京大学人民医院动物实验室无特定病原体动物(Specific Free Animal,SPF)条件的层流架内饲养，饮水自由摄入。雄激素非依赖性前列腺癌细胞系DU145由北京大学第一医院泌尿外科研究所馈赠，北京大学人民医院中心实验室进行常规细胞培养。高频彩色多普勒超声(GE公司LOGIW9高频彩色多普勒超声)测量肿瘤由北京大学人民医院超声科完成。肿瘤标本的甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色在北京大学人民医院中心实验室完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 复苏冻存的前列腺癌细胞系DU145，用含体积分数10%胎牛血清(杭州四季青公司)的1640培养液(北京天润善达公司)在37 ℃、50 mL?L-1CO2孵箱内培养。2.5 g?L-1的胰酶与体积分数0.02%的EDTA(杭州吉诺生物公司)消化传代培养。肿瘤细胞贴壁生长。由于DU145细胞系生长迅速，应注意每天给细胞换液。

　　1.2.2 原位种植模型建立 当肿瘤细胞生长至对数增长期，胰酶消化，1000 r?min-1离心5 min(无锡瑞江牌离心机，型号RJTDL40B),重新悬于无血清的1640培养液中，调整细胞密度，台盼蓝染色选择细胞存活率大于90%的细胞悬液。继续用无血清的1640培养液调整细胞浓度2×107 ?mL-1。裸鼠采用质量分数0.7%戊巴比妥钠0.01 mL?g-1腹腔注射麻醉。取仰卧位，胶带固定四肢，酒精消毒皮肤，取下腹部低位横切口，小心分离皮下组织、脂肪、肌肉层后进入腹腔，游离膀胱至颈部，前列腺则在膀胱颈背部腹膜下。用1 mL显微注射器抽取0.10 mL细胞悬液，把细胞吹打均匀，经腹膜进针，一次性注射到前列腺包膜下，且无细胞悬液溢出，前列腺部位立即鼓起1个小包，标志注射成功。棉签轻微按压片刻，80号缝线单层缝合，关闭腹腔。本次实验共种植11只裸鼠，3只由于麻醉及手术意外死亡。

　　1.2.3 高频彩色多普勒超声监测 8只裸鼠按照种植先后顺序编号为1～8号，第2周至第5周，按顺序每周取出2只做高频彩色多普勒超声监测。裸鼠采用质量分数0.7%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，使用12～16MHz的超频探头对前列腺部位监测。在充盈膀胱的低密度回声衬托下，清晰显示出前列腺肿瘤。记录肿瘤的横径与纵径、肿瘤血流、内部回声、组织坏死、局部浸润以及远处转移情况。

　　1.2.4 超声与实际卡尺测量肿瘤的相关性 每次对裸鼠前列腺肿瘤超声监测时，由2名超声科大夫分别对同1裸鼠肿瘤横径与纵径分别测量3次完成，并计算出3次测量的平均值。超声测量完成后在麻醉状态下解剖裸鼠，开腹显露前列腺肿瘤，研究者在未知超声测量结果的情况下，使用游标卡尺测量肿瘤横径与纵径3次，并计算出3次测量的平均值。肿瘤体积计算方式大多数采用[1]，肿瘤体积=短径2×长径×0.5236。

　　1.2.5 HE染色 肿瘤组织在1.3 mol?L-1甲醛中固定24 h，石蜡包埋固定并做连续性切片。苏木素-伊红染色、显微镜下观察。

　　1.3 统计学处理 计量资料以±s表示。使用SPSS 13.0软件得出超声与实际游标卡尺测量肿瘤横径的Pearson与Spearman相关系数，超声与实际游标卡尺测量肿瘤纵径的Pearson与Spearman相关系数。

　　2 结果

　　2.1 原位模型建立 8只裸鼠于种植后第2周均可触摸到绿豆大小硬结，质硬、活动度差，裸鼠精神状态尚佳。以HE染色证实肿瘤是否种植成功，结果表明第8号裸鼠“肿瘤”为囊肿，成瘤率87.5%。当进行相关分析时，采用7只成瘤鼠。

　　2.2 高频彩色多普勒超声监测与实际测量结果 8只裸鼠于种植后第2周至第5周，按顺序每周取出2只做高频彩色多普勒超声监测。7只裸鼠使用超声测量的横径与使用游标卡尺测量的横径相比，Pearson与Spearman相关系数分别是0.996(P<0.001)与0.964(P<0.001);7只裸鼠使用超声测量的横径与使用游标卡尺测量的纵径相比，Pearson与Spearman相关系数分别是0.988(P<0.001)与0.898(P<0.01)。超声测量与游标卡尺测量呈高度正相关。经超声测量第6号与第7号裸鼠肿瘤体积分别为(119.9±8.9)mm3与(126.7±9.6)mm3，均>50 mm3，其余4只裸鼠肿瘤体积均<50 mm3，见表1。7只成瘤鼠超声均在充盈膀胱液性暗区衬托下，于膀胱颈部可清晰地显示种植肿瘤,肿瘤呈低回声，边界清晰。其中4号成瘤鼠超声测量肿瘤横径是2.6 mm，纵径是2.1 mm。见图1。该裸鼠前列腺原位种植肿瘤、精囊、膀胱取出在体外的照片，见图2。表1 裸鼠前列腺原位种植肿瘤使用高频彩色多普勒超声与实际游标卡尺测量的结果

　　2.3 HE染色结果 所有成瘤鼠可见个别前列腺样结构;肿瘤细胞围绕前列腺腺泡生长，为低分化腺癌结构，肿瘤细胞异形性明显,极向消失，排列紊乱;胞核大小不一、核大深染,并可见较多核分裂像;有巨核细胞,间质成分少，见图3。

　　3 讨论

　　人前列腺癌动物模型是研究前列腺癌发病机制、肿瘤与宿主关系、癌肿侵袭与转移过程和治疗措施有效性不可缺少的理想实验工具,裸鼠因其免疫缺陷特性成为建立人类肿瘤动物模型的最佳载体.以往制作前列腺癌裸鼠模型时多选择皮下作为荷瘤部位,接种方便、易于观察,但是根据Paget的“种子与土壤”( Seed and Soil)学说,肿瘤的生长和转移依赖于一个合适的微环境,因此原位种植较皮下接种具有更高的致瘤率，且皮下移植瘤模型并不能很好地模拟前列腺癌在人体内的自然生长过程以及许多生物学行为,而原位种植不仅使肿瘤细胞获得了更接近人体内的生长微环境,而且其中丰富的内源性生长因子,能够提高移植成功率,并形成与临床相似的转移模式[2]。当今抗肿瘤药物的临床前试验主要使用皮下种植肿瘤，因为皮下种植肿瘤可以方便地使用卡尺测量其直径或体积，观察药物作用的效果。但是前列腺皮下种植肿瘤不可以进行抗血管药物以及抗转移性肿瘤药物的临床前试验[3]。

　　在临床肿瘤的治疗中，患者对抗癌药物治疗的效果可以通过肿瘤在影像学上的表现反映出来。近年影像学技术包括超声、CT、MRI以及一些显微成像技术发展非常迅速[45]，一些研究者利用MRI可以精确地发现小鼠膀胱内的微小肿瘤，并测量出肿瘤的体积，可以很好地做出纵向监测，但是MRI监测价格昂贵、需要花费很长的时间限制了其在动物实验中的应用。高频彩色多普勒超声由于在技术上的简便性、非侵袭性、费用低与操作时间短，在鼠类原位种植肿瘤的监测中优于MRI。在前列腺癌动物模型中也有研究者使用经直肠超声监测[68]，但是需要特殊的腔内小探头。本次实验使用经腹部超声清楚显示出肿瘤，并可以精确测量肿瘤体积，观察肿瘤的形态、内部回声、彩色血流、内部坏死、远处转移情况。

　　本次实验过程中，一裸鼠肿物的高频彩色多普勒超声监测发现在膀胱的液性暗区衬托下，疑似原位种植肿瘤。最后HE染色结果是一囊肿。所以高频彩色多普勒超声不可以完全确定肿瘤是否种植成功，最后在判断结果时要以HE染色为标准。

　　在抗肿瘤药物的临床前研究中，有2种给药方式。一种是肿瘤细胞种植当天或稍后给予药物，称为肿瘤生长的抑制研究;另一种是当种植肿瘤生长到50～200 mm3给与药物，称为肿瘤生长的推迟研究。推迟研究提供的证据优于抑制研究[9]。裸鼠前列腺原位种植肿瘤模型中，当肿瘤生长到体积为50 mm3左右时，也许已经超过该肿瘤的指数增长期，此时将给予药物容易出现假阳性结果。本次实验共有5只肿瘤体积在50 mm3以下，7只肿瘤使用超声与实际卡尺测量均呈高度正向关。说明高频彩色多普勒超声可以很好地描述纵向肿瘤的生长情况，尤其在肿瘤生长的早期。本实验将进一步使用高频彩色多普勒超声绘制每只裸鼠前列腺原位种植肿瘤的生长曲线，找出肿瘤的指数生长期或者体积倍增时间，为临床前抗肿瘤药物的干预治疗提供合适的时间窗。高频彩色多普勒超声也可以准确地描述出肿瘤血供、坏死、浸润、转移，是一种很好的、非侵袭性的监测工具，也可以应用于转基因鼠前列腺癌模型的纵向监测。

　　【参考文献】

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　　[2] 罗 勇，张林琳，贺大林.裸鼠前列腺原位模型的建立[J].第四军医大学学报，2005,26(19):17971799.

　　[3] Kelland LR.Of mice and men:values and liabilities of the athymic nudemouse model in anticancer drug development[J].Eur J Cancer,2004,40(6):827836.

　　[4] Mazurchuk R,Glaves D,Raghavan D.Magnetic resonance imaging of response to chemotherapy in orthotopic xenografts of human bladder cancer[J].Clin Cancer Res,1997,3(9):16351641.

　　[5] Weissleder R.Scaling down imaging molecular mapping of cancer in mice[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):1118.

　　[6] Wirtzfeld LA,Wu G,Bygrave M,et al.A new threedimensional ultrasound microimaging technology for preclinical studies using a transgenic prostate cancer mouse model[J].Cancer Res,2005,65(14):63376345.

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　　[8] Kraaij R,Van Weerden WM,De Ridder CM,et al.Validation of transrectal ultrasonographic volumetry for orthotopic prostate tumours in mice[J].Lab Anim,2002,36(2):165172.

　　[9] Teicher BA.Tumor models for efficacy determination[J].Mol Cancer Ther,2006,5(10):24352443.

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