针刺对兔不完全性截瘫损伤脊髓bFGF免疫组化阳性表达动态影响

　　【摘要】目的：探讨针灸治疗不完全性截瘫对bFGF阳性表达的影响及其对脊髓损伤修复的意义。方法：采用不完全性截瘫兔模型，于伤后6 h、7 d、15 d取损伤脊髓组织3 mm长，用免疫组织化学S-P法染色，并用美国产Optimas6.51彩色图象分析系统进行图像分析。结果：造模后，bFGF表达主要在脊髓白质部位，并于第7 d开始针灸组脊髓白质灰质阳性颗粒表达明显下降，出现低谷，而模型组明显上升，第15 d均稍有恢复。结论：针灸作用于截瘫早期脊髓损伤的机理为对内源性bFGF的抑制，7 d时明显降低BFGF合成释放，达到抗瘢痕形成，抗粘连作用，从而减轻继发性损害有关，为脊髓功能恢复提供了有利条件。本文选自：《针灸临床杂志》是由中华人民共和国新闻出版总署、正式批准公开发行的优秀期刊。自创刊以来，以新观点、新方法、新材料为主题，坚持"期期精彩、篇篇可读"的理念。针灸临床杂志内容详实、观点新颖、文章可读性强、信息量大，众多的栏目设置，针灸临床杂志公认誉为具有业内影响力的杂志之一。针灸临床杂志并获中国优秀期刊奖，现中国期刊网数据库全文收录期刊。

　　【关键词】针灸;脊髓损伤/脊髓损伤修复;bFGF阳性表达

　　截瘫尤其是不完全性截瘫已成为临床的常见病和疑难病，其主要原因是伤后继发损害不断加重，发展最终导致不可逆改变。针灸对其疗效确切，以成为截瘫恢复的重要手段之一。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一个多功能因子，能刺激血管生成和神经元的增殖、分化。其神经营养作用包括促进神经细胞再生和存活，保护受损神经细胞抵御兴奋性氨基酸的神经毒作用[1]。随着研究的深入，它对神经系统生长、发育中的作用越来越受到重视。我们对针刺不完全性截瘫兔的损伤脊髓部位的bFGF阳性表达作了动态对比观察，以探讨针灸治疗截瘫的机理。报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　①实验动物与分组：由湖南中医学院日本大耳白兔饲养中心，提供健康雄性日本大耳白兔70只，体重2.0～2.5 kg。随机分为非脊髓损伤组，造模损伤6 h组、7 d组、15 d组，针刺6 h组、7 d组、15 d组，每组10只;②兔不完全性截瘫模型的制备：兔不完全性截瘫模型采用压迫法[2]，造成不完全性脊髓损伤，正常对照组与模型组、针灸治疗组一样常规麻醉，显露第七腰椎间孔切断黄韧带，插入麻醉导管胶囊，并用皮肤尾线固定，但不注入典必乐，不予压迫，24 h后拔掉导管;③模型组不行治疗，针灸治疗组在模型形成后6 h内即开始针灸治疗。

　　1.2　针灸治疗方法

　　1.2.1　头皮针刺激法

　　头针运动区、感觉区，沿头皮分三段刺入帽状腱膜下，施小幅度高频率捻转手法，再配以电针(不完全性截瘫多表现为迟缓性瘫，采用断续波)增加刺激量。每次25 min，1次/d。

　　1.2.2　针灸督脉方法：

　　在损伤脊髓平面上、下两椎体棘间隙各进一针至硬膜外，捻转勿提插，得气后通以微量电流[波形同(1)]。损伤早期可采用隔姜灸督脉损伤部位。每次25 min，1次/d。

　　1.2.3　配合体针刺

　　取“环跳”“委中”“殷门”“涌泉”“次髎”等穴。针刺行平补平泻法，留针25 min，1次/d。

　　1.3　标本采集及观察指标

　　1.3.1　在模型形成6 h、7 d、15 d时，空气栓塞分批处死大耳白兔。电镜液固定损伤脊髓部位，取3 mm长，损伤脊髓用10%的中性福尔马林固定液再固定，常规石蜡包埋切片，经He常规染色后镜下观察出血、坏死、炎性渗出情况，每组筛选3～5个阳性反应显著标本行免疫组化染色分析。

　　1.3.2　主要试剂

　　兔抗兔bFGF单克隆抗体、SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色剂(由武汉博士德生物工程有限公司提供)。

　　1.3.3　bFGF免疫组化染色

　　①石蜡切片常规脱蜡至水;②10%过氧化氢37℃孵育10 min，微波抗原修养;③羊血清孵育10 min，滴加-抗4℃过夜;④滴加二抗37℃孵育30 min;⑤滴加三抗37℃孵育30 min;⑥DAB显色苏木素复染;⑦脱水透明封片。

　　1.4　图象分析和统计处理

　　应用美国产Optimas 6.51彩色图象分析系统(湖南中医学院诊断所提供)在10×40倍视野光学显微镜下对bFGF免疫组织化学染色阳性反应物进行定量检测，分别拍摄并测定损伤脊髓灰质，(前、后角，灰质联合共5个视野)和白质(前后索侧索共6个视野)灰、白质共11个视野阳性信号数和灰度(Mean Gray)。用SPSS.11.5统计软件进行方差分析，P<0.05视为有显著性差异[3]。

　　2　结果

　　2.1　免疫组织化学染色显微镜下结果，见下图。

　　2.2　针灸组、模型组图象灰度与阳性信号数变化对比分析

　　见表1-3，动态变化见表4。表1　脊髓灰、白质6 h时相变化表2　脊髓灰、白质7 d时相变化　　表3　脊髓灰、白质15 d时相变化　表4　脊髓灰、白质不同阶段的动态变化

　　数据通过方差分析q检验得出：模型组白质灰质各时相灰度无显著差异(P>0.05)。灰质中，造模第7 d时阳性信号数显著升高(P<0.05)。白质中，于造模第7 d、第15 d出现阳性信号数升高。针刺组白质灰质的灰度在第7 d、第15 d升高。阳性信号数6 h显著高于7 d时，并于第7 d出现阳性信号低谷，差异显著(P<0.05)。15 d时又升高，基本同于正常组。针灸第7 d时，灰白质灰度均显著升高，信号数显著下降，为控制瘢痕形成，减少粘连创造了有利条件。为治疗损伤修复进入关键阶段。针灸组灰白质比较：6 h、15 d时阳性信号数白质明显高于灰质。

　　3　讨论

　　bFGF，在截瘫损伤过程中参与神经元保护与修复及促进突触再生的作用已被证实[4]。有研究表明，中枢神经系统损伤局部环境存在自我修复因素，多种生长因子表现为短暂性升高[5]。同样，当脊髓发生损伤时，脊髓组织细胞外基质中的bFGF被大量激活，以诱导毛细血管生长、引起炎性细胞介质的聚集，通过促进细胞的有丝分裂，来促使成纤维细胞的增殖。从而，有bFGF参与形成的瘢痕组织便成为了神经细胞再生的障碍之一。在本研究中，可以见到在不完全性截瘫兔模型造模后第7 d bFGF的阳性表达出现显著升高，在第15 d时稍有回落，神经原细胞水肿明显，并可见炎性浸润、血管组织增生，表明bFGF的表达与脊髓的继发性损伤密切相关。7 d时为神经组织瘢痕形成期，模型组7 d显著升高，说明bFGF既是促进神经元保护修复的因素，又是形成瘢痕的因素之一。

　　从截瘫的治疗方法来看，现代应用于临床的主要是手术及康复治疗。截瘫手术，如“脊髓断端缝合术”、“神经根脊髓植入术”、“肋间神经马尾神经吻合术”等，手术难度大，术后的瘢痕粘连是手术成功率小的主要原因，手术创伤大，术后仍须进行长时间的康复治疗，临床上不能被普遍接受和采用。至于康复治疗，西医主要靠神经组织自身的功能“苏醒”及功能锻炼，亦未取得明显疗效。近年来，针灸作为康复手段治疗截瘫取得了一定进展，疗效卓著，具有很好的临床应用前景。然而，针灸作用机理还远未被阐明。已有研究表明，针灸作用于神经损伤的途径之一可能是与减轻或抑制了bFGFmRNA的表达有关[6]。本实验采用免疫组织化学方法检测了针灸作用于截瘫模型的bFGF动态表达。结果显示，针灸治疗组bFGF阳性表达主要表现在脊髓白质部位，6 h显著增高为第一高峰，是截瘫形成自身保护、自我修复因素的良好信号。损伤第7 d出现bFGF阳性信号数明显降低，呈现一个低谷，与模型组7天达到最高峰相反。与光镜下神经原细胞水肿等炎性表现明显较模型组减轻相一致，提示针灸作用于截瘫早期脊髓损伤的机理与对内源性bFGF的抑制有关。针灸通过作用于受损的脊髓组织抑制bFGF在体内的合成，减轻了其促进成纤维细胞增殖的作用，减少炎性细胞聚集，从而抗瘢痕抗粘连有利于神经营养物质顺利通过及与神经再生创造良好条件，减轻脊髓继发性损伤，为截瘫的恢复提供了有利条件。针灸作用于脊髓bFGF表达的时相变化，可为针灸治疗截瘫的临床研究机理探讨提供参考依据。

　　【参考文献】

　　1　林剑.碱性成纤维细胞生长因子[J].暨南大学学报(自然科学版),1993,14(1)：99.

　　2　刘洁，胡湘明，等.建立兔急性压迫型不完全性截瘫模型的实验研究[J].湖南中医学院学报，2003,10(5)：1-4.

　　3　贺石林，等.中医科研设计与统计学[M].长沙：湖南科学技术出版社，2003.331-332.

　　4　Tao Y，Black IB，Dcicco-Bloom E.Neurogenesis in neonatal rat brain is regulated by peripheral injection of basic fibroblast growth factor(bFGF)[J].J Comp Neuro-1,1996,376：653.

　　5　Frautschy SA，Walicke PA，Baird A.Localization of basic fibroblast growth factor and its mRNA after CNS injury[J]. Brain Res,1991,553：291.

　　6　刘世敏，等.不同针灸疗法对颈椎椎间盘退变模型大鼠bFGFmRNA表达的影响[J]上海针灸杂志，2003,22(11)：25-27.

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